【摘 要】
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目的:近二十年来中国肺癌导致的死亡人数超过癌症总死亡人数的20%,且发病率及死亡率增长迅速。非小细胞肺癌患病人数约占肺癌患者的85%,虽然通过手术治疗能够切除病灶区,但后期仍存在较高的复发率,且预后不尽人意。科罗索酸是一种天然的五环三萜类化合物,在抗肿瘤方面具有非常广阔的应用前景。抗肿瘤药物具有诱导肿瘤细胞凋亡的多种途径,其中氧化应激产生的活性氧与肿瘤细胞凋亡存在密切关系,而科罗索酸作为一种有效抑
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目的:近二十年来中国肺癌导致的死亡人数超过癌症总死亡人数的20%,且发病率及死亡率增长迅速。非小细胞肺癌患病人数约占肺癌患者的85%,虽然通过手术治疗能够切除病灶区,但后期仍存在较高的复发率,且预后不尽人意。科罗索酸是一种天然的五环三萜类化合物,在抗肿瘤方面具有非常广阔的应用前景。抗肿瘤药物具有诱导肿瘤细胞凋亡的多种途径,其中氧化应激产生的活性氧与肿瘤细胞凋亡存在密切关系,而科罗索酸作为一种有效抑制肿瘤生长的中药单体,其药理作用可能是通过氧化应激来实现诱导肿瘤细胞凋亡的。因此,本课题以非小细胞肺癌作为研究对象,以氧化应激作为研究重点,寻找氧化应激相关信号通路的上下游,揭示科罗索酸抑制非小细胞肺癌生长的作用机制。方法:1.MTT法检测不同浓度科罗索酸(1、2.5、5、10、25、50、100、250μmol/L)对肺癌细胞系H1650、SPC-A-1、A549、H460的生长影响。2.配置不同浓度的科罗索酸(0、5、10、15、20、25μmol/L)与非小细胞肺癌H1650细胞混合培养,MTT法检测科罗索酸对H1650细胞的生长影响。3.应用DCFH-DA探针检测不同浓度科罗索酸对H1650细胞内ROS的影响。4.科罗索酸与氧化应激/信号通路相关抑制剂联合应用,MTT法检测其对H1650细胞生长的影响。应用DCFH-DA探针,检测科罗索酸与氧化应激/信号通路相关抑制剂联合应用,对细胞内ROS的影响。5.Western Blot法检测不同浓度科罗索酸对H1650细胞蛋白表达的影响。科罗索酸与氧化应激/相关信号通路有关抑制剂联合应用,检测其对H1650细胞中Smad、p38、JNK1/2、ERK1/2等信号通路中关键蛋白及其磷酸化水平的影响。6.应用非小细胞肺癌H1650细胞构建裸鼠实体瘤模型,分为空白组、对照组、阳性药组(顺铂)、科罗索酸不同剂量组,连续灌胃给药14天,每天测量瘤体积、称取裸鼠体重。动物处理后,统计瘤组织体积、重量等指标变化。应用Western Blot法检测不同浓度科罗索酸对瘤组织相关指标的蛋白检测,例如,Smad2、p38、JNK1/2、ERK1/2、cleaved-Caspase3、Caspase3。结果:1.科罗索酸能够抑制不同类型肺癌细胞系H1650、SPC-A-1、A549、H460的生长。2.科罗索酸抑制非小细胞肺癌H1650细胞生长,并呈浓度依赖性;科罗索酸浓度低于20μmol/L对wi-38细胞的生长没有明显影响。3.DCFH-DA探针检测H1650细胞内ROS的变化,结果表明不同浓度科罗索酸处理H1650细胞后,RFU值呈浓度依赖性增长,表明科罗索酸能够诱导H1650细胞生成ROS。4.抗氧化剂预处理后与科罗索酸联用,与单用科罗索酸处理组相比,NAC、Catalase、Apocynin预处理组的RFU值明显下降,说明抗氧化剂能够抑制科罗索酸诱导H1650细胞生成ROS。5.抗氧化剂与科罗索酸联用能够促进H1650细胞生长,如与Tocopherol、NAC、Catalase、Apocynin联用组,与单用科罗索酸处理组相比,存在显著性差异。6.Western Blot法检测表明,随着科罗索酸浓度增加,细胞浆中Smad2蛋白的磷酸化水平也逐渐提高,呈剂量依赖性;与此同时,p38和JNK1/2蛋白磷酸化水平也逐渐提高。细胞核蛋白中Smad2、Smad3蛋白水平也逐渐提高,表明科罗索酸能够促进Smad2、Smad3蛋白的核移位。7.氧化应激相关通路抑制剂与科罗索酸联用组,能够促进H1650细胞的生长,如SB525334、PD98059、SB203580,与科罗索酸单用组相比,存在显著性差异。8.动物实验结果表明,2.5mg/kg-40mg/kg科罗索酸组能够有效抑制H1650肿瘤细胞生长。Western Blot法检测瘤组织相关蛋白表达发现,与对照组相比,科罗索酸组(2.5mg/kg-40mg/kg)Smad2蛋白磷酸化水平表达上调,p38蛋白磷酸化水平则下调,具有统计学意义;科罗索酸组(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)cleaved-Caspase3蛋白表达上调,具有统计学意义。结论:1.科罗索酸能有效抑制不同肺癌细胞系的生长,包括非小细胞肺癌。2.科罗索酸通过氧化应激诱导非小细胞肺癌凋亡。3.科罗索酸主要是通过调控MAPK中p38信号通路,提高Smad信号通路中Smad蛋白的磷酸化水平并促进发生核移位,激活caspase信号通路,诱导非小细胞肺癌凋亡。
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