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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)而引起的高度传染性疾病,该疾病会造成母猪繁殖障碍和仔猪肺炎、生长发育缓慢、死亡率增加。PRRSV具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强作用以及持续性感染等特点,能够抑制或逃逸宿主的先天性免疫系统和获得性免疫系统的抵御。而目前市场开发的传统PRRSV疫苗无法提供有效保护,至今仍无切实有效的治疗措施。因此开发能够作用不同PRRSV毒株,为猪群提供广泛保护的抗病毒策略已成为当前PRRSV防控面临的重大挑战。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类长度为18~23 nt的单链非编码小RNA,是一种能够在转录后水平调控基因表达的内源性调节因子。许多研究证实microRNA在PRRSV感染宿主细胞的过程中,通过靶向调控病毒受体的表达参与病毒与宿主互作机制,发挥着调控病毒感染及宿主免疫应答的重要作用。已有研究发现,CD163是病毒感染宿主的关键受体。本研究将利用生物信息学方法,以PRRSV的细胞受体CD163为靶基因,探索调控CD163表达的宿主microRNA在PRRSV感染过程中所发挥的作用及其作用原理,从而为PRRS的防治提供新策略。研究内容包括以下几个方面:1.靶向PRRSV受体CD163的宿主microRNA的筛选及靶位点的确定首先,在NCBI数据库下载猪源和猴源的CD163 mRNA的3’UTR序列,利用生物信息学软件(UCSC、miRbase、RNA22 V2、RNAhybrid)预测到4个可以靶向CD1633’UTR的成熟microRNAs:miR-124a、miR-143-3p、miR-338、miR-450b-3p。然后,利用psiCHECK-2报告质粒构建具有双荧光素酶识别位点的重组载体,双荧光素酶报告基因检测发现:其中的miR-124a能够结合到猴源和猪源受体CD163的3’UTR区域,有效的抑制报告质粒上荧光素酶的活性(抑制率高达61%)。随后对miR-124a调控CD163表达的靶位点种子序列进行突变,构建具有突变型序列的双荧光素酶重组质粒。最后,将合成的microRNA模拟物与野生型及突变型双荧光素酶重组质粒共转染HEK293T细胞。经过双荧光素酶报告基因检测发现:miR-124a与突变型重组质粒3’UTR区域的结合力下降,抑制报告质粒活性的能力降低。证明了miR-124a能够特异性结合到猪源CD163 3’UTR区的138~144位点与猴源CD163 3’UTR区的31~36位点。2.miR-124a对CD163分子调控机制的研究为探索miR-124a对CD163分子的调控机制,分别在PAMs细胞和MARC-145中过表达miR-124a模拟物,通过荧光定量PCR技术和Western blot技术检测CD163在mRNA与蛋白质水平上的表达变化。结果表明,miR-124a能够下调CD163分子在mRNA与蛋白质水平上的表达。通过转染不同浓度(20 nm、50 nm、100 nm)的miR-124a模拟物后,进一步研究发现miR-124a呈浓度梯度依赖性抑制CD163分子在mRNA与蛋白质水平的表达。3.miR-124a在PRRSV感染过程中的功能研究为了进一步研究miR-124a在病毒感染中所发挥的作用,利用荧光定量PCR技术检测了不同PRRSV毒株感染宿主后受体CD163以及miR-124a的表达情况,发现在高致病性毒株HP-PRRSV HNP5(0.01MOI)以及低致病性毒株N-PRRSV CH-1R(0.01MOI)感染后均存在受体CD163表达上升以及miR-124a表达下降的趋势,进一步验证了病毒感染过程中miR-124a对于受体CD163的调控作用。利用相对荧光定量、绝对荧光定量、TCID50和Western blot等技术检测发现在PRRSV病毒天然宿主细胞(PAM)中,过表达miR-124a的模拟物能够有效抑制高致病性毒株HP-PRRSV HNP5与低致病性毒株N-PRRSV CH-1R在宿主细胞中的复制。综上所述,本研究从病毒与宿主细胞相互作用的角度,阐明了宿主miR-124a对PRRSV受体CD163分子的调控作用,并深入探究了其抑制PRRSV复制的分子机制。该研究结果不仅有助于更好的理解受体介导的PRRSV与宿主细胞的互作机制,也可为PRRSV防控提供新的策略。