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拟在大肠杆菌中构建一个能通过简单的诱导反式进行诱导的高效启动子系统。本文首先采用PCR克隆了大肠杆菌的β-半乳糖苷酶(lacZ)作为报告基因,构建了启动子探针质粒pSP-Z。采用PCR法克隆了大肠杆菌的3个含有操作子的启动子序列(Padi,Pato,Pnar),将其克隆于启动子探针质粒中报告基因的上游,分别通过测量β-半乳糖苷酶的酶活测得三个启动子诱导前后的转录活性。确定将Padi作为研究对象进行进一步的两方面的研究。
采用PCR重叠延伸法对Padi的-10区和-35区分别进行点突变,筛选获得7个活性不同的突变株(Padi-14,Padi-16,Padi-17,Padi-19,Padi-23,Padi-116,Padi-126),分别测量活性和诱导效率。结果发现在除了Padi-17以外的6个启动子的突变株中,启动子转录活性大大提高。
PCR扩增Padi的调控蛋白adiY,并将其装入不同启动子(Plac,Ptrc,自身启动子)下游分别表达,其中Ptrc表达产物经过初步提纯,进行凝胶阻滞实验,结果发现adiY蛋白对含有Padi的DNA片段的电泳迁移率有明显的影响。将Plac和自身启动子介导下的adiY表达盒分别装入获得的启动子突变质粒。