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本研究从烟台附近潮间带的海泥样品中,分离到海洋放线菌348株,并对其次级代谢产物进行了生物活性筛选,获得了它们对七株农业病原菌抗菌活性数据。发现具有选择性抗菌活性的比例约为34.8%。同时根据前人的实验数据,选取了本实验室前人分离的生物活性较好的30株海洋放线菌进行了七株农业病原真菌的活性筛选。结果表明30株放线菌的次级代谢产物均表现了选择性的抑菌活性,显示了海洋放线菌在筛选农用抗生素方面的巨大潜力。
根据抗菌活性初筛结果,选取了活性较好的M268、M543、LM080、L242及M086五株放线菌,利用六种培养基,两种pH和两种培养温度,共24个培养条件对菌株进行了培养条件优化,通过生物活性筛选和化学筛选相结合,确定了优化范围内五株菌的最佳培养条件,分别为M543-ME-Ⅲ、M268-FF-Ⅲ、LM080-CL-Ⅲ、L242-SM-Ⅳ和M086-FF-Ⅱ。与此同时,通过活性跟踪初步确定了优化条件下次级代谢产物的活性部位。
通过对菌株优化条件下次级代谢产物的生物活性筛选及化学筛选结果,选取了M268、M543和LM080三株放线菌,分别按其最佳培养条件进行30 L或50 L发酵。综合利用正相、反相硅胶、Sephadex LH-20、PTLC、HPLC等各种色谱技术,共分离出33个化合物。通过综合波谱分析(1D、2D NMR和MS)、化学反应等方法鉴定了化合物的结构,包括3个新颖结构的聚酮化合物,Kiamycin(19),1,4-dimethoxy-3-(3-hydroxy-3-methyl-1-tetralone)-1(3H)-isobenzofuran A(20),1,4-dimethoxy-3-(3-hydroxy-3-methyl-1-tetralone)-1(3H)-isobenzofuran B(21);5个已知聚酮,Griseoviridin(1),Borrelidin(10),8-O-methyltetrangomycin(22),8-O-methylrabelomycin(23),X-14881 F(24);以及其他25个已知化合物如下:1-Acetyl-beta-carbolin(2),1-Methyluracil(3),m-Hydroxybenzyl alcohol(4),Anthranilic acid(5),Vanillic acid(6),Poly-(hydroxybutyricacid)(7),(+)-Nonactic acid(8),(+)-Homononactic acid(9),1(10)E,5E-Germacradiene-3,11-diol(11),4S,7R-Germacra-1E,5E-dien-11-ol(12),3-Hydroxy-6-[(Z)-3’-hydroxy-2’,4’-dimethyl-hept-4-enoylamino]-2,4-dimethyl-5-oxo-hex-anoicacid(13),p-Hydroxyphenylethyl alcohol(14),R-mevalonolactone(15),5-Methylthioadenosine(16),(4S)-4,10,11-Trihydroxy-10-methyldodec-2-en-1,-olide(17),4,10-Dihydroxy-10-methyl-11-oxo-dodec-2-en-1,4-olide(18),E-1-(4’-hydroxyphenyl)-buten-3-one(25),Arbutin(26),Ferulic acid(27),3,4,5-Trihydroxybenzoicacid(28),4-methyl-2,6-dihydroxybenzaldehyde(29),2-Hydroxyphenyl-acetamide(30),thymine(31),β-carboline(32),1,2,3,4-tetrahydro-1一methyl-β-carboline-3-carboxylic acid(33)。
对新结构化合物进行了生物活性筛选,其中化合物19在100μM浓度时,对肿瘤细胞株HL-60、A549和BEL-7402的抑制率分别为68.2%,55.9%和31.7%;化合物20在100μM浓度时,对肿瘤细胞株HL-60、A549和BEL-7402的抑制率分别为4.4%,44.7%和30.7%,化合物20无抑菌作用和抗乙酰胆碱脂酶活性。
通过比较菌株M268和W007的16S rDNA序列,发现来源于相同泥样的两株菌序列完全相同。因此基于W007的全基因组序列,通过比较类似结构的生物合成基因的核苷酸序列,推测了来源于M268的苯并蒽醌类聚酮化合物的生物合成途径。