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胆固醇摄入过量带来的高血脂症、冠心病、动脉硬化等心血管疾病已经严重危害到人体健康,如何减少胆固醇摄入量、降低人体血清胆固醇水平的研究越来越受到广泛关注。国外已有大量关于乳酸菌降胆固醇作用的文献报道,但具体的去除机理尚不明确,仍有多种观点并存。本文旨在研究植物乳杆菌ST-Ⅲ的降胆固醇作用机理,为其能更有效地投入工业生产做好理论基础研究。
研究发现ST-IⅡ菌株降低胆固醇作用受胆盐和胆固醇影响。在培养基中添加不同的胆盐,能增加ST-III菌株降胆固醇能力,依次为牛磺胆酸钠>牛胆盐>胆酸,对于牛胆盐来讲,当添加浓度为3.0g/L时,降胆固醇率达到最高值38.57%;在培养基中添加不同来源和不同浓度的胆固醇,ST-III菌株均具有降低作用,但降低能力有差异,依次为羊血清>鸡蛋黄>卵磷脂-胆固醇胶束溶液,并且降低能力受胆固醇的浓度影响较大,当浓度低于0.5mg/mL时,降胆固醇率可维持在40%左右,高于0.5mg/mL时,降胆固醇效果则显著降低;降胆固醇量则在胆固醇浓度为1.0mg/mL时达到最高值307μg/mL,这可能是高浓度胆固醇抑制ST-III菌株的生长所致。
进一步研究证实,ST-III菌株是通过同化与共沉淀两种作用方式来降低培养基中的胆固醇的,其中同化作用占主导作用,达63.5%,共沉淀占36.5%。在控制与不控制pH值的发酵条件下,均发现ST-III菌株的同化作用占主导地位,在恒定pH6.0的条件下此现象尤为明显。ST-III菌株细胞被热灭活处理后降胆固醇作用明显降低,并且同化降胆固醇量显著减少;研究ST-III菌株处于休眠期细胞的降胆固醇作用也发现同化降胆固醇占主导作用,这都表明了ST-III菌株的降胆固醇作用以同化作用为主。在ST-III菌株的抗超声波实验以及荧光标记实验中发现:添加胆固醇培养的菌体细胞对超声波的抗性增强且细胞膜通透性降低,这间接说明了胆固醇可被ST-III菌株细胞同化进入胞内继而改变细胞膜的组成成分。脂肪酸组成成分分析发现,添加胆固醇培养的细胞内不饱和脂肪酸较对照组有所增加,而饱和脂肪酸降低,这也说明了培养基中的胆固醇可改变细胞内脂肪酸组成,进一步证实了ST-III菌株对胆固醇的同化作用。
在确定植物乳杆菌ST-III主要通过同化作用降低胆固醇后,我们对其可能存在的降胆固醇相关酶进行了研究。实验证实植物乳杆菌ST-III的降低胆固醇的相关酶为胞内酶,并且是诱导酶,当培养基中的诱导物--胆固醇浓度为216μg/mL时,得到降低胆固醇相关酶的酶活最高。在降胆固醇粗酶纯化过程中,TritonX-100采用1%的添加量,采用60%饱和度的硫酸铵沉淀达到的纯化效果最佳,纯化倍数可达到2.5倍和18倍;酶样品经Sephacryl S-100进一步层析纯化后,粗酶纯化倍数达到39.6倍;经PAGE电泳得到该酶的纯品,经SDS-PAGE电泳分析,得到该酶分子量为38,000Da。酶学性质研究表明该酶反应底物浓度为150μg/mL,ATP浓度为2.5mg/mL,最适pH值7.0,最适温度55℃,在60℃、pH6.0~9.0范围内保持30 min酶活基本保持稳定。