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猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是二十世纪八十年代末发现的一种高度传染性疾病，引起妊娠母猪的流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍，以及各种年龄猪（特别是仔猪）的呼吸道疾病。其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），系单股正链RNA病毒，与马动脉炎病毒、鼠乳酸脱氢酶增高症病毒和猴出血热病毒同为最近成立的动脉炎病毒科（Arteriviridae）、动脉炎病毒属（Arterivirus）成员。PRRSV基因组长约15kb，包括8个开放阅读框架（ORF），ORF1a和ORF1b编码病毒复制酶；ORF2～5分别编码病毒的糖蛋白GP2～5；ORF6编码膜蛋白（M蛋白）；ORF7编码保守性的核衣壳蛋白（N蛋白）。根据抗原性差异将各地PRRSV分离株分为欧洲型（原型毒株为LV）和北美洲型（原型毒株为VR-2332）。 1995年，我国首次在北京地区大规模爆发PRRS，随后从流产胎儿体内分离出一株PRRSV，命名为CH-la株。为了弄清流行于我国猪群的PRRSV的来源和遗传学背景，并为进一步研究疫苗防制此病提供依据，本文测定了我国分离的第一株PRRSV CH-la株的基因组全序列，利用序列分析软件对各基因和非编码区进行了分析，并与欧美标准毒株作了比较，绘制了其系统发育进化树。结果表明，CH-la株基因组全长15 432个碱基（b），编码8个开放阅读框架，5′非编码区（NCR）长190b，3′NCR长151b，其后是20b的polyA，ORFla编码的多聚蛋白经切割后生成6个非结构蛋白（Nspα、Nspβ、Nsp2～5），ORFlb编码的聚合蛋白又可切割生成4个非结构蛋白（RdRp、CP2-4），ORFla与ORFlb之间的衔接区为核糖体移码区，有保守的基序5′UUUAAAC3′和拟节结构。CH-la株与VR-2332和LV 5′NCR核苷酸同源性分别为93％和63％，3′NCR分别为95.4％和78.2％，ORF2～7与VR-2332和LV ORF2～7的核苷酸同源性分别在91.5～95.3％和63.5～70.2％，氨基酸同源性分别在88.6～97.6％和61.2～81.0％。这表明CH-la株与流行于北美洲型毒株遗传关系很近，而与欧洲型毒株遗传关系较远，表明流行于我国的PRRSV可能来自北美洲，同时CH-la株与VR-2332也有一定的差异，可能分别属于北美洲型中的不同亚型。 囊膜蛋白GP5是PRRSV的主要结构蛋白和免疫保护性抗原之一，有许多独特的生物学和免疫学功能，在致病和免疫机制中发挥着重要的作用。鉴于此，我们随后用真核表达系统对之进行了体外表达，并对其功能作了初步探讨。 伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）是α疱疹病毒成员，其庞大的基因组中含有多个非必需基因，如TK基因、gE基因、gG基因等，具有开发成病毒活载体的巨大潜力。PRV Bartha-K61株就是gE缺失的疫苗株，为了缺失TK基因以进一步降低其毒力，并探讨外源基因在PRV中表达的可行性，本文构建了通用PRV转移载体以及表达PRRSV GP5基因的重组PRV。首先提取Bartha-K61株基因组，用KpnI充分消化，回收并克隆其KpnI 仇华吉 PRRSV CH．la株基因组解析及其囊膜蛋白结构与功能分析 2001年 5月J片段，然后亚克隆其中的Kphl－Pstl片段，缺失重组质粒中的EcOAI位点和NOtl－Hindlll片段，再用Accl切去378hp，在此缺失位置插入来源于pCR3－Uni的CMV启动子、多克隆位点和 BGH polyA信号，构建了通用 PRV转移载体 pBdTK－Uni。然后，将来源于 pSTK（其中含有 PRV BamHI－门片段）的 1．7kb apnl片段（含有部分 TK及其下游同源序列）将 PngSV GPS基因插入此通用转移载体中，构建成 GPS干RV转移质粒，经纯化与Bartha－K6 株基因组 DNA共转染 PK－15细胞，经反复筛选和蚀斑纯化后获得了表达PRRSV GPS基因的重组伪狂犬病病毒 rPRV－GPS，为开发 PRV／PngSV H价基因工程疫苗，以及基于此的多价疫苗奠定了基础。 昆虫杆状病毒表达系统是一种良好的真核表达体系，以其忠实高效表达而广泛应用于外源基因的体外表达及结构与功能研究。本研究将GPS基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体 pBlueBacHis B上，经鉴定、纯化后，与杆状病毒线性化 DNA（Bac－N－Blue’“DNA）共转染Sfg昆虫细胞，经过三轮蚀斑纯化后，获得重组杆状病毒rHISBS。用PngSV特异性抗血清进行的间接免疫荧光试验显示，在rHisBS感染的sfg细胞周围可见特异性的兔疫荧光。SDS－PAGE和 WCstern blotting分析表明，GPS蛋白基因在杆状病毒系统中获得了表达，其分子量大小分别为22、25和30ku，占细胞蛋白总量的26．4％。重组GPS蛋白可望用作PRRS亚单位疫苗，作为病毒活载体疫苗的补充。 为了分析该基因功能和研制PugS基因疫苗，本文将PRRSV CH－la株Ogys亚克隆至真核表达载体pCR3－Uni的CMV启动子下游，构建成真核表达质粒。以该质粒转染MARC．145细胞，可诱导其发生以DNA断裂和核小体形成为特征的细胞凋亡，同时证实用ORFS基因免疫接种小鼠可诱导其产生特异性抗体应答，为PugS基因免疫提供了依据。 总之，本研究解读了Pn