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研究背景:血管新生可分为两大类,包括生理性和病理性血管新生。生理性血管新生主要发生在胚胎和胎儿发育、伤痕愈合、骨骼生长、月经周期和妊娠等阶段。病理性血管新生主要发生在肿瘤和各种缺血性和炎症性疾病中,包括眼内新生血管性疾病、免疫原性类风湿关节炎和银屑病等。与具有保持静息状态的成熟健康血管的其他眼内新生血管性疾病相比,早产儿视网膜病变（retinopathy of prematurity,ROP）是一种独特的疾病,因为其发育中未成熟的视网膜同时存在生理性和病理性血管新生。目前所有的抗血管生成药物,包括靶向血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的药物,都不加选择地抑制病理性和生理性血管新生,因此任何对新生血管性疾病的缓解都伴随着对健康血管的不利影响。临床研究发现,靶向VEGF/VEGF受体（vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR）信号通路的抗血管生成药物在心血管和肾系统中引发多种与扰乱VEGF依赖性生理功能和稳态相关的副作用,包括高血压、动脉血栓栓塞、蛋白尿和出血等。由于早产儿尚未发育成熟的视网膜和其他全身器官对药物的副作用更为敏感,目前在美国没有批准用于ROP的药物治疗。在过去的三十年中,已有一些研究报道了病理性血管新生的调节剂,但是它们均未被证明完全独立于VEGF信号通路、且/或仅与病理性血管新生相关。最近研究发现分泌粒蛋白Ⅲ（secretogranin Ⅲ,Scg3）作为疾病选择性、非VEGF依赖性促血管生成因子,选择性结合糖尿病视网膜血管,并促进糖尿病小鼠而非正常小鼠的角膜血管新生和视网膜血管渗漏。抗Scg3抗体对眼部病变血管的治疗作用已在多个眼内血管疾病动物模型中得到证实,包括模拟ROP的氧诱导视网膜病变（oxygen-induced retinopathy,OIR）小鼠模型。但是,目前Scg3在ROP中是否具备疾病选择性仍需进一步探究。目的:检测OIR和健康视网膜中Scg3的表达情况;定性、定量比较Scg3和VEGF与OIR和健康视网膜血管的结合能力;通过检测正常和OIR Scg3基因敲除（gene knockout,KO）小鼠视网膜血管和结构表型来推断Scg3在视网膜发育和OIR进展中的作用;评估Scg3抑制剂与VEGF抑制剂的治疗窗,并将Scg3和VEGF的疾病选择性与相应抑制剂的眼部和全身安全性问题相关联。方法:1.检测正常和OIR视网膜中Scg3的表达将出生后第7天（postnatal day 7,P7）的C57BL/6J小鼠与母鼠共同置于体积分数（75±2）%的高氧中饲养,于P12返回室内空气,构建OIR模型。利用视网膜冰冻切片抗Scg3多克隆抗体（polyclonal antibody,p Ab）染色比较P17正常和OIR小鼠视网膜Scg3的表达。2.定量、定性比较Scg3和VEGF与OIR和正常视网膜血管的结合能力利用酶联免疫吸附试验检测Scg3噬菌体（Scg3-Phage）和VEGF-Phage是否具备与同源天然Scg3和VEGF重组蛋白相似的结合基序。对P17 OIR和正常小鼠行体内噬菌体结合试验,取眼球和视网膜/玻璃体/晶状体复合物来进行噬菌体菌斑试验定量比较Scg3、VEGF与视网膜血管的结合能力,或者利用视网膜铺片植物凝集素B4（isolectin B4,IB4）和抗Flag单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）染色可视化探究Scg3、VEGF与视网膜血管的结合能力。3.比较野生型（wild type,WT）小鼠和Scg3-KO小鼠视网膜血管和结构的表型利用视网膜冰冻切片抗Scg3 p Ab染色检测P17 Scg3-WT和Scg3-KO正常小鼠Scg3的表达。通过视网膜铺片IB4染色比较P6、P21 Scg3-WT和Scg3-KO正常小鼠视网膜血管化程度。制备P21 Scg3-WT和Scg3-KO正常小鼠视网膜冰冻切片,通过抗CD31 mAb染色和H＆E染色分别检测各组视网膜血管和结构的发育情况。利用透射电子显微镜检查比较P21 Scg3-WT和Scg3-KO正常小鼠视网膜的超微结构。利用视网膜铺片IB4染色比较P17 Scg3-WT和Scg3-KO OIR小鼠病理性视网膜新生血管（retinal neovascularization,RNV）的严重程度。4.探究抗Scg3人源化抗体Fab段（humanized or human antibody Fab fragment,hFab）对OIR小鼠的治疗效果向P14 OIR小鼠玻璃体腔内注射抗Scg3 hFab、阿柏西普、对照hFab或PBS,利用视网膜铺片IB4染色检测P17各组OIR诱导的RNV的严重程度。向P14OIR小鼠玻璃体腔内注射抗Scg3 hFab、阿柏西普、对照hFab或PBS,利用眼底荧光血管造影（fundus fluorescein angiography,FFA）检测P17各组视网膜血管弯曲和扩张情况。向P14正常和OIR小鼠玻璃体腔内注射抗Scg3 hFab或PBS,利用视网膜冰冻切片抗VEGF mAb染色比较P17各组视网膜VEGF的表达。5.比较抗Scg3 hFab和VEGF抑制剂对视网膜血管发育、功能和结构的影响向P1正常小鼠玻璃体腔内注射抗Scg3 hFab、阿柏西普或PBS,利用视网膜铺片IB4染色探究P4各组视网膜血管化程度。向P5正常小鼠玻璃体腔内注射抗Scg3 hFab、阿柏西普或PBS,利用视网膜铺片IB4染色检测P7各组视网膜血管化程度。向P14 OIR小鼠玻璃体腔内注射抗Scg3 hFab、阿柏西普、对照hFab或PBS,利用暗适应视网膜电图检查评估P21、P42和P60各组视网膜功能,利用谱域光学相干断层扫描（spectral-domain optical coherence tomography,SD-OCT）或视网膜冰冻切片H＆E染色来探究P42各组视网膜厚度和结构。利用体外噬菌体结合试验定量比较Scg3-Phage和VEGF-Phage与人视网膜微血管内皮细胞（human retinal microvascular endothelial cell,HRMVECs）和SK-N-AS细胞的结合能力。6.比较抗Scg3 hFab和VEGF抑制剂的全身安全性分别在P1、P3、P5、P7、P9、P11向正常小鼠腹腔内注射抗Scg3 hFab、阿柏西普或PBS,每日记录各组体重,在P12摘取各组肾脏制备冰冻切片和石蜡切片,分别行AF594-抗CD31 mAb染色和H＆E染色观察各组肾血管和结构的发育情况。结果:1.Scg3主要表达于正常视网膜的神经节细胞层（ganglion cell layer,GCL）、内丛状层（inner plexiform layer,IPL）、外从状层（outer plexiform layer,OPL）和未成熟的光感受器层（immature photoreceptor layer,PRL）,其在内核层（inner nuclear layer,INL）的表达减弱,在外核层（outer nuclear layer,ONL）几乎无表达。OIR并未改变Scg3的表达水平和分布。2.Scg3-Phage和VEGF-Phage可分别表达与其同源天然Scg3和VEGF重组蛋白相似的结合基序。计数与血管结合的噬菌体,发现Scg3-Phage选择性与OIR视网膜血管结合,不与健康视网膜血管结合,而VEGF-Phage可同时与OIR和健康视网膜血管结合。功能性免疫荧光染色进一步揭示Scg3-Phage仅与OIR视网膜中新生血管簇和排列杂乱无章的血管结合,而VEGF-Phage可以同时结合OIR视网膜中新生血管簇、排列杂乱无章的血管和组织良好的血管以及健康视网膜血管。3.视网膜冰冻切片抗Scg3 p Ab染色结果显示Scg3-KO小鼠的视网膜不表达Scg3蛋白。与Scg3-WT小鼠相比,Scg3-KO小鼠的视网膜血管发育、视网膜的厚度和结构均无明显异常,但OIR诱导的病理性RNV和中央无血管灌注区得到了显著的改善。4.玻璃体腔内注射抗Scg3 hFab有效缓解了OIR诱导的病理性RNV、动脉迂曲和静脉扩张,其治疗潜力与VEGF抑制剂相当,二者最低有效剂量均为0.5μg/眼。视网膜冰冻切片抗VEGF mAb染色结果显示玻璃体腔内注射抗Scg3hFab并未改变视网膜VEGF的表达。5.VEGF抑制剂呈剂量依赖性地抑制新生小鼠视网膜血管发育,而抗Scg3hFab在最高剂量（20μg/眼）下不抑制视网膜血管生长。VEGF抑制剂在P60显著抑制OIR小鼠的a波振幅,在P21、P42和P60显著抑制b波振幅,在P42延长了b波潜伏期、减少了总视网膜厚度、INL厚度和光感受器内外节（photoreceptor inner and outer segments,PIS/POS）厚度。未检测到抗Scg3 hFab对视网膜功能和结构有长期不利影响。Scg3-Phage不与SK-N-AS细胞结合,与HRMVECs的特异性结合水平仅为背景的10.1%。VEGF-Phage与HRMVECs或SK-N-AS细胞的特异性结合水平分别为背景的54.3%和30.0%。6.腹腔内注射VEGF抑制剂显著抑制新生小鼠的体重增长、阻碍肾血管发育、造成肾小管损伤和肾小球纤维化。而抗Scg3 hFab处理组小鼠的体重、肾血管和肾结构无任何异常。结论:Scg3在视网膜的表达不受OIR的影响。Scg3选择性地与OIR而非健康视网膜血管结合。敲除Scg3基因可有效缓解OIR诱导的病理性RNV而不影响正常视网膜血管发育,说明Scg3严格靶向调节病理性而非生理性血管新生。抗Scg3hFab可有效缓解OIR诱导的病理性RNV、动脉迂曲和静脉扩张,对视网膜血管发育、视网膜功能和结构无不利影响,同时具备全身安全性,满足作为一种安全、有效的靶向抗血管生成治疗方式的基本标准。