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棉花是世界上重要的纤维作物,我国是产棉大国,棉花在我国国民经济中具有重要地位。棉纤维是由胚珠外珠被表皮细胞经突起并极性伸长而成的单细胞,是棉花的主要经济产品。纤维细胞的生长发育经历了细胞分化突起、极性伸长、次生壁形成和脱水成熟等过程,形成了纤维细胞的产量和品质,因此研究纤维细胞的发育及其影响因素,对培育高产优质棉花纤维具有重要意义和实践价值。同时,纤维发育持续时间较长,几个过程区分明显,因此纤维细胞也是研究植物细胞生长发育的理想材料。细胞骨架在细胞发育中具有重要作用,微管是细胞骨架的主要成分。纤维细胞发育中微管排列模式随纤维生长有规律变化,表明微管在纤维细胞生长发育中具有重要作用。但微管骨架调控纤维细胞生长的相关机制还知之甚少。微管主要由α-和β-微管蛋白组成,在植物基因组中含有多个α-和β-微管蛋白基因,尽管微管蛋白基因在序列上高度保守,部分基因却有明显的组织器官和发育特异性,说明不同的微管蛋白基因可能在植株发育过程中发挥不同的功能。棉花中部分微管蛋白基因在纤维细胞中特异高表达,暗示这些基因与纤维细胞发育有密切关系,但这些基因的具体功能及其调控机制尚不清楚。陆地棉基因组中有38个β-微管蛋白基因,其中GhTUB7基因在纤维细胞中特异表达,且在细胞次生壁合成期高表达,暗示GhTUB7基因与纤维产量品质(长度、强度和细度)有密切关系。为进一步解析GhTUB7在纤维发育中的功能及调控机理。本研究通过克隆棉花微管蛋白家族成员GhTUB7及其上游启动子,在转基因棉花中上调和下调GhTUB7的表达水平,观测转基因棉花纤维的性状变化。分析GhTUB7基因表达变化与纤维性状变异的关系,阐明GhTUB7基因在纤维生长发育中的功能;同时通过启动子功能分析,揭示GhTUB7在纤维发育中的调控机制,为进一步完善纤维细胞的生长发育理论提供实验数据。主要结果如下:1.克隆了棉纤维特异表达微管蛋白基因GhTUB7GhTUB7 cDNA序列长1471 bp,包含一个长1335 bp的ORF,推测的氨基酸序列长444aa,分子量50 kD,等电点4.766。GhTUB7基因编码的蛋白序列具有tubulin保守区域,其与水稻,玉米,可可,大豆等β-微管蛋白家族均具有很高的同源性。在系统进化上与可可亲缘关系较近。2.明确了GhTUB7基因表达模式数字表达谱搜索和实时定量PCR都证明GhTUB7在纤维细胞中特异表达,在根、茎、叶、花、雄蕊、雌蕊中表达极低。其表达水平在纤维细胞次生壁合成起始期开始增加,在20DPA纤维中达到表达峰值,随后稍有下降但仍保持较高水平。该结果表明GhTUB7是个纤维特异性较强的纤维发育后期基因,在纤维次生壁合成过程中具有重要作用。3.鉴定了棉花纤维特异启动子GhTUB7PGhTUB7是个纤维发育后期特异表达的基因,对其启动子的研究不仅能够阐释GhTUB7的调控机制,也能为研究和应用提供纤维后期特异表达启动子。为此,克隆了GhTUB7基因上游2010 bp的调控序列,同时进行启动子5’删除实验,以期获得该启动子核心启动区段。对获得的转基因棉花进行不同组织部位GUS组织化学染色,结果表明,在根、茎、叶等部位均未检测到GUS信号。在对不同发育时期的纤维进行检测,结果显示10DPA时GUS信号较弱,随后信号逐渐增强,其在20DPA-30DPA呈现强GUS信号。由此说明GhTUB7P是一个纤维特异性较高的强启动子。4.GhTUB7对棉花纤维发育的影响超量表达GhTUB7基因抑制纤维细胞的起始和伸长,转基因纤维长度与野生型相比降低了8.73~12.2%,促进了纤维素合成酶基因的表达,纤维细胞壁增厚。GhTUB7表达上调降低纤维细胞对秋水仙素的敏感性。相反,抑制GhTUB7基因的表达对纤维细胞起始无明显影响,有利于纤维伸长,转基因纤维长度与野生型相比增加了13.2%~15.2%,降低了纤维素合成酶基因的表达,不利于次生壁沉积。证明GhTUB7基因在纤维细胞发育中的主要功能是调控次生壁的合成,是影响纤维产量和品质的一个重要基因。