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氯乙基亚硝基脲(CENUs)作为一种重要的双官能团抗癌烷化剂,目前广泛的应用于多种恶性肿瘤的临床治疗。研究表明,氯乙基亚硝基脲分解生成活泼的亲电子中间体与DNA形成加合物,从而诱导产生互补碱基对之间的横向交联、链的断裂等损伤,最终导致癌细胞凋亡。该类药物在发挥其抗癌作用的同时也具有致癌副作用,能够引起二次肿瘤的产生。因此,研究氯乙基亚硝基脲诱导的DNA损伤对揭示药物的抗癌机理与致癌作用之间的差异有着重要意义,对癌症的预防与治疗具有重要意义。本课题以此为出发点,通过分子生物学、细胞生物学方法研究氯乙基亚硝基脲诱导的DNA损伤及其细胞生理上的变化。主要采用CCK-8法、单细胞凝胶电泳和流式细胞术方法对CENUs导致的DNA损伤进行定性和定量检测分析。
首先,通过CCK-8法检测了卡莫司汀对NIH/3T3小鼠胚胎细胞的毒性。结果表明,随着卡莫司汀浓度的增加,细胞存活率下降。卡莫司汀对NIH/3T3细胞的半抑制浓度为43μg/mL。
其次,利用单细胞凝胶电泳检测不同浓度卡莫司汀作用NIH/3T3细胞2小时诱导的DNA损伤。结果表明,每一个剂量组都会诱导DNA产生断裂,并且随着卡莫司汀浓度的增加,DNA产生的断裂越多,呈现剂量.效应关系。卡莫司汀作用细胞的时间越长,产生的断裂约多。30μg/mL卡莫司汀作用细胞2小时,弃去药物后继续培养不同时间,检测DNA损伤后的修复情况。结果表明,去药后继续培养6小时可以观察到明显的修复；去药后继续培养24小时,几乎观察不到断裂。通过姬姆萨染色发现经药物处理过的细胞在形态上表现为细胞固缩、细胞核深染。随着培养时间的增加,出现多核体现象。
最后,使用流式细胞术检测卡莫司汀对NIH/3T3细胞周期的影响。结果表明,卡莫司汀诱导的DNA损伤,使得细胞周期停在了S期。当修复完成后细胞进入正常的细胞周期。
综上所述,本课题通过使用CCK-8法、单细胞凝胶电泳和流式细胞术方法检测了卡莫司汀作用NIH/3T3细胞导致的DNA损伤及其修复。这些方法具有简单、灵敏、快速等特点,从细胞水平上进一步揭示了氯乙基亚硝基脲类药物的抗癌机理,对于今后开发具有高效低毒的抗癌药物具有重要意义。