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为使禽流感H9N2亚型病毒样颗粒疫苗尽快投入市场,有效防控H9N2禽流感,本课题拟从传统的白油佐剂、新型的ISA 206佐剂和微球佐剂中筛选出一种最适用于禽流感H9N2亚型病毒样颗粒疫苗的佐剂。本课题主要内容包括以下几个部分。1禽流感H9N2亚型病毒样颗粒的制备本试验首先合成禽流感亚型H9N2病毒的HA基因、NA基因、M1基因,再将这三个基因先后插入杆状病毒表达载体形成重组质粒,重组质粒导入感受态细胞中蓝白斑筛选后提取质粒进行鉴定。将筛选出的合格的重组质粒转染sf9昆虫细胞,经过P1代、P2代、P3代转染,最后将P3代继续转染sf9昆虫细胞,最终得到H9N2病毒样颗粒工作液。结果显示:H9N2病毒样颗粒工作液为透明的淡黄色液体。2白油佐剂、ISA 206佐剂、微球佐剂病毒样颗粒疫苗的制备与筛选2.1白油佐剂病毒样颗粒疫苗的制备与筛选本试验利用本实验室保存的H9N2亚型病毒样颗粒工作液,加入不同体积的白油、乳化剂和不同质量的硬脂酸铝采用高速分散器乳化得到不同油水比和不同硬脂酸铝浓度的白油佐剂H9N2病毒样颗粒疫苗。本试验对制备出的白油佐剂疫苗进行了黏度检验、稳定性检验、无菌检验和安全性检验,结果显示:白油佐剂疫苗的稳定性检验、无菌检验和安全性检验均合格,油水比为3:1、硬脂酸铝浓度为0.5%的白油佐剂病毒样颗粒疫苗最适合用于后续与其他两种佐剂之间的筛选。2.2 ISA 206佐剂病毒样颗粒疫苗的制备与筛选本试验利用进口佐剂ISA 206按体积比为1:1的比例采用连通管法乳化禽流感H9N2亚型病毒样颗粒工作液制备出ISA 206佐剂疫苗。本试验对ISA 206佐剂疫苗进行了黏度检验、稳定性检验、无菌检验和安全性检验,结果显示:ISA 206佐剂H9N2亚型病毒样颗粒疫苗黏度检验、稳定性检验、无菌检验和安全性检验均合格,可用于后续与其他两种佐剂之间的筛选。2.3微球佐剂病毒样颗粒疫苗的制备与筛选本试验利用壳聚糖、吐温80、硫酸钠、乙酸为原料制备出微球,与本实验室保存的H9N2病毒样颗粒工作液吸附得到微球佐剂疫苗。本试验为提高微球的载药量和包封率优化了微球与病毒样颗粒工作液的吸附条件,结果显示:微球吸附病毒样颗粒工作液的最佳时间为3h,5mg微球最佳吸附体积为8m L,载药量可达89.04%。本试验对微球佐剂疫苗进行稳定性检验、无菌检验和安全性检验。结果显示:微球佐剂H9N2病毒样颗粒疫苗的稳定性检验、无菌检验和安全性检验结果均为合格,可用于后续与其他两种佐剂之间的筛选。3不同佐剂禽流感H9N2亚型病毒样颗粒疫苗免疫效果评定为筛选出禽流感H9N2亚型病毒样颗粒疫苗的最优佐剂,本试验将试验雏鸡随机分组并对各组雏鸡免疫前后出现的临床体征、溶菌酶含量、体液免疫水平和细胞免疫水平进行测定。临床体征检测包括对各试验组进行采食量、体温、呼吸频率、体重、注射部位是否出现局部或全身反应,以及各试验组雏鸡精神状况和排泄物是否正常等方面的检测。结果显示:免疫前后各试验组食欲无肉眼可见变化;各组试验蛋鸡的体温、呼吸频率、体重均无显著差异(P>0.05);白油佐剂疫苗和标准商品化疫苗在注射试验雏鸡后会引起局部反应;不加佐剂的病毒样颗粒疫苗组、微球佐剂病毒样颗粒疫苗组、生理盐水组、微球佐剂阴性对照组在首次免疫后,其精神状况比其他各组好。溶菌酶含量的高低是反映动物机体非特异性免疫水平高低的一个指标。对溶菌酶含量的测定结果显示:21日龄时,微球佐剂病毒样颗粒疫苗口服组和微球口服阴性对照组的溶菌酶含量极显著高于其他组的溶菌酶含量(P<0.01),微球佐剂病毒样颗粒疫苗口服组和微球口服阴性对照组之间无显著差异(P>0.05);14日龄和35日龄时,各组间溶菌酶的含量均无显著差异(P>0.05)。本试验用甲醛和戊二醛分别制备了醛化红细胞并测定了其保存时间,结果显示:制备的两种醛化红细胞存放9个月时,其被H9N2尿囊液凝集的效果与新鲜红细胞无显著差异(P>0.05);两种醛化红细胞放置12个月时,新鲜红细胞被H9尿囊液凝集的效果极显著高于醛化红细胞组(P<0.01)。本试验对免疫后各时期的各试验组进行了体液免疫水平和细胞免疫水平的测定,结果显示:不添加佐剂的病毒样颗粒进入机体后产生了有效的体液免疫水平,但其持续时间短、抗体水平低;添加了佐剂的病毒样颗粒疫苗进入试验蛋鸡机体内,均产生了有效的体液免疫水平,且它们的持续时间和抗体水平更长、更高;其中微球佐剂禽流感H9N2亚型病毒样颗粒疫苗口服组的体液免疫水平比白油佐剂疫苗组、ISA 206佐剂疫苗组和微球佐剂疫苗注射组都要高且持续时间更长;各试验组均未产生有效的细胞免疫水平。研究表明:白油佐剂、ISA206佐剂、微球佐剂这三种佐剂中,微球佐剂比其他两种佐剂更适合用于禽流感H9N2亚型病毒样颗粒疫苗的佐剂。微球佐剂疫苗口服的免疫途径比注射的免疫途径更方便,且能获得更高的体液免疫水平和更长的持续时间。