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呋喃它酮是一种硝基呋喃类抗生素，其原药及代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮(AMOZ)对人体有致癌、致畸等副作用，许多国家已禁止使用。因为呋喃它酮药效好，价格低，目前违法使用现象仍然严重，因此加强其在相关产品中的残留检测十分必要。呋喃它酮原药在生物体内不稳定，代谢迅速，无法直接检测，通常将其代谢物AMOZ作为靶标检测物。 免疫分析方法具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、成本低、处理样本量大等优点，在食品安全领域有广阔的应用前景。抗体的质量是建立免疫分析法的关键。基因工程抗体技术，给快速制备高灵敏度和特异性及低成本抗体提供了一条新途径。本论文从前期获得的分泌产生抗AMOZ衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞出发，采用RT-PCR技术和重叠延伸PCR技术构建单链抗体基因，对其进行表达、纯化、活性鉴定和生物信息学初步分析，建立基于单链抗体的间接竞争酶联免疫吸附分析(icELISA)和间接竞争化学发光酶免疫分析(icCLEIA)两种免疫检测方法，并在单链抗体基础上进行双价抗体构建的初步研究。主要研究内容及结果如下： (1)抗AMOZ衍生物scFv基因构建、表达与活性鉴定 从分泌产生抗AMOZ衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆抗体VH和VL基因，大小分别为348 bp和321 bp，通过(G4S)3连接肽采用重叠延伸PCR技术构建scFv基因，以pET-22b(+)为表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)为表达系统，经IPTG诱导表达，目的蛋白分子量约为27 kD。采用icELISA法对Ni柱亲和纯化的目的蛋白进行活性鉴定，发现其能够特异性识别AMOZA-OVA包被抗原，抗体效价1:640，NPAMOZ药物对抗体有抑制作用。 (2)抗AMOZ衍生物scFv生物信息学分析 根据IMGT数据库中V-QUES工程序分析，单链抗体重链和轻链抗体可变区均含有4个FR区和3个CDR区。根据ExPASy Proteomics tools分析，单链抗体分子量25636.4，共有238个氨基酸残基组成，理论等电点8.61，分子式C1124H1724N314O357S9。NCBI数据库同源性分析显示有和AMOZscFv的VH或VL氨基酸序列高度同源的序列存在。二级结构预测显示scFv含α螺旋22处，β转角28处，随机卷曲106处，延伸带结构82处。三维分子模拟可观察到6个CDR环区形成的抗原结合位点，具有典型的“口袋”形单链抗体结构特征。 (3)基于单链抗体的AMOZ icEIASA和icCLEIA检测方法研究 利用重组单链抗体对icELISA和icCLEIA工作条件进行优化。得到的icELISA最优工作条件为AMOZA-OVA包被原浓度62.5 ng/mL，单链抗体稀释倍数20倍，在最优icELISA条件下，建立测定NPAMOZ的标准曲线，计算得到IC5011.35 ng/mL，LOD1.94 ng/mL，线性检测范围3.81～69.93 ng/mL；得到的icCLEIA最优工作条件为AMOZA-OVA包被原浓度62.5 ng/mL，单链抗体稀释倍数10，竞争免疫反应时间45min，抗His标签抗体孵育时间和稀释度分别为60 min和1:2000，HRP酶标记羊抗鼠抗体孵育时间和稀释度分别为50 min和1:10000，加入化学发光底物液轻轻振荡混匀后立即测定RLU值。在最优icCLEIA条件下，建立测定NPAMOZ的标准曲线，计算得到IC501.79 ng/mL，LOD0.12 ng/mL，线性检测范围0.34～11.80 ng/mL。icCLEIA方法与icELISA方法相比，具有更高灵敏度和更宽检测范围。 对icELISA和icCLEIA两种方法进行方法学评价。两种方法精密度实验的批内和批间平均相对标准偏差均小于10％；除呋喃它酮原药以外，两种方法测定的抗AMOZ衍生物scFv与其它硝基呋喃类抗生素及其代谢物的交叉反应率均小于0.1％；icELISA方法添加回收率67.04％～73.20％，icCLEIA方法添加回收率72.25％～78.56％，两种方法加标回收结果与HPLC-MS/MS测定结果相关性均良好。 (4)双价抗体初步研究 选用pSEX81噬菌粒载体构建双价抗体基因。以pET-22b(+)为表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)为表达系统，经IPTG诱导表达双价抗体蛋白，得到的双价蛋白分子量约为55 kD。采用icELISA法对Ni柱亲和纯化的目的双价抗体蛋白进行活性鉴定，发现其能够特异性识别AMOZA-OVA包被抗原，抗体效价1:16，NPAMOZ药物对其有抑制作用，IC50633.99 ng/mL，线性检测范围76.75～4833.13 ng/mL，最低检测限30.01 ng/mL。和亲本单链抗体相比，活性不太理想。对造成双价抗体活性不太理想的可能原因进行分析，为后续工作的开展打下一定的基础。