论文部分内容阅读
目的:研究巨噬细胞冠蛋白-1(Coronin-1)不同表达水平对i NOS、TLRs表达和凋亡的影响及其可能机制。方法:1.据Coronin-1表达水平的差异,将实验组细胞分为RAW264.7-Cor.Plus(过表达)、RAW264.7(正常表达)和RAW264.7-Cor.Minus(抑制表达)三组。用Realtime PCR法检测Coronin-1不同表达水平巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)m RNA水平;Western-blot法检测细胞Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs),其中主要检测TLR2、TLR4、TLR9的蛋白表达水平;流式细胞术检测各组细胞凋亡百分率。2.各组细胞经4μmol/L的钙调磷酸酶抑制剂环孢素A(cyclosporin A,Cs A)处理24h,用Western-blot法检测Cs A处理前后Coronin-1不同表达水平巨噬细胞钙调磷酸酶的蛋白质表达。RAW264.7(正常表达)组细胞经2μmol/L肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D(cytochalasin D,cyt D)处理48h后,用四甲基异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(TRITC-phalloidin)对细胞染色,计算Coronin-1不同表达水平巨噬细胞以及cyt D处理前后RAW264.7细胞纤维型肌动蛋白(F-actin)重排率。3.各组细胞经4μmol/L环孢素A(Cs A)和2μmol/L细胞松弛素D(cyt D)分别处理24h和48h。用Realtime PCR法检测i NOS m RNA水平;Western-blot法检测细胞TLR2、TLR4、TLR9的蛋白质水平;流式细胞术检测细胞凋亡百分率。结果:1.RAW264.7-Cor.Minus(抑制表达)组细胞,其i NOS、TLR2、TLR4、TLR9的表达以及细胞凋亡率与RAW264.7(正常表达)组细胞相比没有显著差异(P>0.05)。RAW264.7-Cor.Plus(过表达)组细胞与RAW264.7组细胞相比,i NOS、TLR2、TLR4、TLR9表达以及细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。各项指标趋势为:RAW264.7>RAW264.7-Cor.Plus(P<0.05)。2.巨噬细胞钙调磷酸酶表达水平与Coronin-1不同表达水平呈正相关。RAW264.7-Cor.Plus(过表达)、RAW264.7(正常表达)和RAW264.7-Cor.Minus(抑制表达)三组细胞的钙调磷酸酶表达水平依次降低。经Cs A处理后,RAW264.7和RAW264.7-Cor.Plus组细胞钙调磷酸酶表达水平显著低于未处理组(P<0.05)。钙调磷酸酶表达水平呈现趋势:RAW264.7-Cor.Plus>RAW264.7>RAW264.7-Cor.Minus;RAW264.7>RAW264.7+Cs A;RAW264.7-Cor.Plus>RAW264.7-Cor.Plus+Cs A(P<0.05)。经TRITC-phalloidin染色后,各组细胞F-actin重排率从高至低依次为RAW264.7-Cor.Plus、RAW264.7、RAW264.7-Cor.Minus(P<0.05)。cyt D处理组细胞,其F-actin重排率显著低于未处理组(P<0.05)。3.RAW264.7-Cor.Plus组细胞经Cs A处理后,其i NOS、TLR2、TLR4、TLR9表达以及细胞凋亡率显著高于未处理组(P<0.05)。各项指标趋势为:RAW264.7-Cor.Plus+Cs A>RAW264.7-Cor.Plus(P<0.05)。cyt D处理前后,RAW264.7-Cor.Plus组细胞i NOS m RNA表达和细胞凋亡率并无显著差异,但RAW264.7和RAW264.7-Cor.Plus组细胞TLR2、TLR4、TLR9的表达都被显著抑制,这种效应与Coronin-1的表达水平无关。结论:1.Coronin-1过表达抑制巨噬细胞i NOS、TLR2、TLR4、TLR9表达和细胞凋亡。2.Coronin-1过表达可促进巨噬细胞Ca N蛋白表达和F-actin重排。Cs A可抑制巨噬细胞Ca N的表达;cyt D对细胞F-actin重排具有显著抑制效应,但与Coronin-1表达水平无关。3.Coronin-1可能通过激活钙调磷酸酶信号通路,抑制巨噬细胞i NOS、TLRs表达和细胞凋亡,这一过程并不依赖于F-actin调节。