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胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，近年来患病率逐年上升且日益年轻化。幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的重要病因，并与胃腺癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的发病密切，但其致瘤分子机制尚不清楚。
细胞毒素相关基因A(cytotoxinassociated-geneA,CagA)是Hp的重要毒力因子，通过细胞毒素相关因子致病性岛Ⅳ型分泌系统(typeⅣsecretionsystem,TFSS)导入细胞后被内源性Src络氨酸蛋白激酶(Srchomology2(SH2)-containingtyrosinephosphatase，SHP-2)磷酸化，然后与SHP-2磷酸酶的结合并诱发其活化。磷酸化的CagA触发一系列的细胞内信号转导通路变化；而使用SHP-2特异性磷酸酶抑制剂calpeptin可完全抑制SHP-2，阻断这一信号转导通路引发的生物学行为改变。
p21/WAF1/CIP1(p21)是目前已知的具有最广泛激酶抑制活性的细胞周期素依赖性激酶抑制子(Cyclin-dependentkinaseinhibitor,CDKI)，在细胞周期中起负性调节作用，抑制细胞增殖，使细胞周期不能进入S期而停滞在G1期。p21与各种细胞周期素Cyclin以及细胞周期素依赖性激酶CDK(Cyclin-dependentkinase)组成了细胞周期抑制因子与激活因子网络，共同调节细胞周期的转换及动态平衡。由于p21的异常转录或表达与多种恶性肿瘤发生发展密切相关，它被认为是一个重要的抑癌基因。在胃癌发生发展的多阶段过程中，随着胃黏膜病变恶性程度的增高而p21表达降低。
本研究拟从Hp毒性因子CagA入手，以CagA野生型及其同基因突变体CagA突变型Hp菌株为实验对照诱导体系，研究幽门螺杆菌CagA介导Cdx2调控p21表达的信号转导，并结合Cdx2及p21在胃癌癌变多阶段病变过程中的表达情况，探讨Cdx2及p21在肠型胃癌发病中的可能机制。
本研究分两部分：
第一部分幽门螺杆菌CagA介导Cdx2调控p21表达的信号转导
第1节幽门螺杆菌CagA诱导AGS胃癌细胞Cdx2表达失调
目的：观察幽门螺杆菌CagA诱导的AGS胃癌细胞Cdx2核移位改变以及对Cdx2表达水平的影响。
方法：采用CagA野生型和CagA突变型Hp菌株，以不加幽门螺杆菌菌株为空白对照，分别诱导人胃癌细胞株AGS(幽门螺杆菌与细胞比例为100：1)，根据实验需要在不同时间点收获细胞。采用间接免疫荧光法联合激光共聚焦荧光显微镜技术(LCFM)观察幽门螺杆菌CagA诱导Cdx2核移位改变，Westernblot、RT-PCR和RealTimePCR分别用于观察Cdx2蛋白及mRNA的表达。
结果：LCFM显示，加入CagA野生型幽门螺杆菌诱导前，AGS细胞Cdx2蛋白主要表达在胞浆，加入CagA野生型幽门螺杆菌诱导后，Cdx2蛋白在细胞核的分布逐渐增多，并呈时间依赖性增强，提示在CagA野生型幽门螺杆菌诱导下，Cdx2蛋白由胞浆移位到胞核；而在CagA突变型幽门螺杆菌中，Cdx2蛋白的核移位不如CagA野生型幽门螺杆菌诱导明显；而在未加幽门螺杆菌菌株的空白对照组没有观察到Cdx2由细胞浆向细胞核的移位。用calpeptin处理后，CagA野生型Hp诱导下AGS细胞的Cdx2核移位较处理前减弱。
RT-PCR和RealTimePCR结果均显示，cagA野生型Hp诱导下AGS细胞的Cdx2mRNA表达呈时间依赖性增加；在诱导后12小时时间点对比AGS细胞分别在cagA野生型及cagA突变型Hp作用下的Cdx2mRNA表达，发现cagA野生型Hp诱导的Cdx2mRNA表达水平明显高于cagA突变型Hp；calpeptin处理后，cagA野生型Hp诱导细胞Cdx2mRNA水平明显下降，而在cagA突变型Hp诱导细胞中Cdx2下调不明显。
Westernblot结果显示，cagA野生型Hp诱导下AGS细胞的Cdx2蛋白表达呈时间依赖性增加，12小时达到高峰并维持在较高水平，因此，我们在12小时时间点进行阻断实验；在诱导后12小时时间点对比AGS细胞分别在cagA野生型及cagA突变型Hp作用下的Cdx2蛋白表达，发现cagA野生型Hp诱导的Cdx2蛋白表达水平明显高于cagA突变型Hp；calpeptin处理后，cagA野生型Hp诱导细胞Cdx2蛋白水平明显下降，而在cagA突变型Hp诱导细胞中Cdx2蛋白下调不明显。
结论：幽门螺杆菌CagA可诱导转录因子Cdx2核移位改变，并导致Cdx2在mRNA及蛋白质表达水平上调。
第2节幽门螺杆菌CagA诱导AGS胃癌细胞Cdx2失调引发p21异常表达
目的：研究Cdx2在p21启动子区是否具有结合活性，并探讨幽门螺杆菌CagA在AGS胃癌细胞诱导的Cdx2失调能否引发p21的异常表达。
方法：用非同位素凝胶移动迁移率检测方法(SUPER-EMSA)检测检测转录因子Cdx2与DNA结合状态；Westernblot、RT-PCR和RealTimePCR方法观察cagA野生型/突变型Hp诱导下以及calpeptin阻断后AGS细胞的p21mRNA和蛋白表达变化。
结果：EMSA显示，在cagA野生型Hp诱导下AGS细胞Cdx2与p21探针结合，呈时间依赖性增强；cagA突变型Hp诱导下AGS细胞Cdx2与p21探针结合能力明显下降。
RT-PCR和RealTimePCR结果均显示，cagA野生型Hp诱导下AGS细胞的p21mRNA表达呈时间依赖性下调；在诱导后12小时时间点对比AGS细胞分别在cagA野生型及cagA突变型Hp作用下的p21mRNA表达，发现cagA野生型Hp诱导的p21mRNA表达水平明显低于cagA突变型Hp；calpeptin处理后，cagA野生型Hp诱导细胞p21mRNA水平明显上调，而在cagA突变型Hp诱导细胞中p21上调不明显。
Westernblot结果显示，cagA野生型Hp诱导下AGS细胞的p21蛋白表达呈时间依赖性减少；在诱导后12小时时间点对比AGS细胞分别在cagA野生型及cagA突变型Hp作用下的p21蛋白表达，发现cagA野生型Hp诱导的p21蛋白表达水平明显低于cagA突变型Hp；calpeptin处理后，cagA野生型Hp诱导细胞p21蛋白水平明显增强，而在cagA突变型Hp诱导细胞中p21蛋白增强不明显。
结论：Cdx2与p21启动子区结合位点(TTTAT)结合，幽门螺杆菌CagA诱导Cdx2表达失调导致p21的异常表达。
第3节幽门螺杆菌CagA诱导下p21异常表达导致胃癌细胞周期的异常改变
目的：研究幽门螺杆菌CagA诱导下细胞周期各个时相细胞的动态变化以及相关p21蛋白含量表达。
方法：利用流式细胞术分析幽门螺杆菌CagA诱导下细胞周期各个时相的动态变化，并采用DNA含量和平均荧光强度双参数方法检测p21蛋白实时表达。
结果：cagA野生型Hp诱导下，随着时间推移，AGS细胞G1期细胞下降，S期细胞明显增加，G2期的细胞无明显变化；在12小时时间点进行阻断实验，结果显示：与cagA野生型Hp相比，cagA突变型Hp诱导AGS细胞G1期细胞增加；同时S期细胞下降，G2期的细胞无明显变化，上述效应与cagA密切相关。
cagA野生型Hp诱导AGS细胞后，与对照组相比，AGS细胞p21相对荧光强度逐渐下降；在12小时时间点进行阻断实验，结果显示：与cagA野生型Hp相比，cagA突变型Hp诱导AGS细胞12小时后，AGS细胞p21相对荧光强度相对增强，p21的相对荧光强度改变与cagA密切相关。
结论：幽门螺杆菌CagA可诱导p21异常表达，引发细胞周期失调。
第二部分Cdx2和p21在胃癌癌变多阶段组织中蛋白表达和意义
目的：在前期研究基础上，检测Cdx2及p21在人体胃癌癌变多阶段组织中的表达，进一步在体内水平验证其在肠型胃癌演变过程中的作用。
方法：采用免疫组织化学ABC法检测104例慢性浅表性胃炎、98例慢性萎缩性胃炎、112例胃黏膜肠上皮化生、106例胃黏膜不典型增生和93肠型胃癌组织中Cdx2及p21蛋白的表达。
结果：Cdx2在慢性浅表性胃炎和慢性萎缩性胃炎组织中无表达，在胃黏膜肠上皮化生组织中的蛋白表达阳性率显著高于胃黏膜不典型增生和肠型胃癌(P＜0.05)，阳性表达率分别为86.6％(97/112)、58.5％(62/106)和56.9％(53/93)。
p21在胃癌癌变多阶段组织中均有表达，表达阳性率分别为92.3％(96/104)、89.8％(88/98)、58.0％(65/112)、52.8％(56/106)、46.2％(43/93)。在慢性胃炎的表达阳性率显著高于肠上皮化生、不典型增生和肠型胃癌(P＜0.05)。
在肠上皮化生、不典型增生和肠型胃癌中，Cdx2和p21表达水平具有显著相关性(P＜0.05)，二者表达模式相反。
结论：Cdx2可能为胃黏膜组织肠上皮化生病变的特异性标志物，Cdx2蛋白过表达以及p21蛋白表达减少或缺如在肠型胃癌的发生中发挥重要作用，而Cdx2可能对p21的表达起负相调节作用。