论文部分内容阅读
凋亡是颅脑创伤后神经细胞死亡的一种主要方式,但关于创伤后细胞凋亡发生的确切机制目前尚不清楚。研究表明促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)在神经系统损伤后,抗凋亡等机制发挥神经保护和神经营养作用,但其机制尚不确切。本研究旨在:1、通过动物实验的方法,观察大鼠颅脑损伤后脑组织中X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)与第二个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂(second mitochondria-derived activator of caspase,Smac或Smac/DIABLO)的表达变化及其与细胞凋亡之间的关系,以探讨它们在颅脑创伤中的作用;2、观察重组人促红细胞生成素(r-HuEPO)对大鼠颅脑损伤后脑组织XIAP和Smac/DIABLO表达的影响,并探讨二者在EPO抗凋亡机制中的作用。目的:1、观察颅脑创伤后伤侧脑组织XIAP与Smac/DIABLO蛋白的表达变化及其与细胞凋亡的关系,探讨它们在颅脑创伤后细胞凋亡中的作用;2、研究r-HuEPO对大鼠颅脑损伤后脑组织XIAP和Smac/DIABLO表达的影响,并探讨二者在EPO抗凋亡机制中的作用。方法:选用Wistar大鼠66只,随机分为假手术对照组(n=6)及颅脑损伤对照组(TBI组,30只)及r-HuEPO治疗组(r-HuEPO组,30只),颅脑损伤对照组和r-HuEPO治疗组分别按2、6、24、72h、7d时间点分为5个亚组,每组6只。采用自由落体法建立大鼠脑创伤模型,分别于伤后不同时间点采集标本,应用免疫组织化学法检测XIAP与Smac/DIABLO蛋白表达变化,采用TUNEL法检测神经细胞凋亡。数据采用SPSS11.5软件处理,多组间比较采用完全随机设计的方差分析(One-Way ANOVA),相同时间点两组比较采用Independent-Samples t检验。P＜0.05认为有统计学意义。结果:1、颅脑损伤后2h即发现神经细胞凋亡率明显升高,伤后24小时达高峰,此后开始缓慢下降,但直至伤后7天仍高于对照组水平;r-HuEPO组除在伤后2h外其它各时相点的细胞凋亡率均较TBI组明显降低;2、颅脑损伤后2h大鼠XIAP和Smac/DIABLO的表达开始增加,伤后各时间点表达均高于假手术组,7d时仍高于正常,Smac/DIABLO表达幅度均小于XIAP。XIAP表达在伤后6h达高峰;而Smac/DIABLO在伤后24h才达高峰;3、r-HuEPO组在颅脑损伤后从2h到72h各时间点XIAP的表达均较TBI组增高,高峰仍在6h,7d的表达虽仍高于TBI组但无统计学意义;与TBI组相比r-HuEPO组从6h到7d各时间点Smac/DIABLO的表达显著降低,2h的表达无明显变化。结论:1、颅脑创伤后存在着广泛的细胞凋亡现象,且凋亡细胞主要分布在创伤灶周边的脑组织中,r-HuEPO通过抗凋亡作用减少神经细胞凋亡而发挥神经保护作用;2、颅脑损伤后XIAP表达升高且出现在伤后早期,可通过抑制Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的活性及RING锌指结构域泛素降解Caspase等多种途径抑制凋亡而对脑损伤后神经细胞继发凋亡早期损害起保护作用;3、正常情况下Smac/DIABLO在大鼠神经细胞胞浆只有极低的表达,颅脑损伤后可以诱导Smac/DIABLO的表达,并使其从线粒体移位至胞浆参与凋亡。伤后2h表达增加,高峰在伤后24h出现与凋亡高峰一致,说明表达存在时间空间的依赖性,并通过抑制XIAP等多种IAP成员的抗凋亡作用而促进凋亡的发生;4、EPO通过:①使核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)活化并向核内易位,增加抗凋亡因子XIAP等的合成和分泌;②抑制Caspase-3、Caspase-9等半胱氨酸蛋白酶的生成和活化,减少了XIAP的降解并维持其较高的活性,从而增加颅脑损伤后XIAP表达。另外EPO增加颅脑损伤后Bcl-2/Bax比例,抑制Smac/DIABLO从线粒体的释放以及XIAP表达的增加对其泛素降解作用使Smac/DIABLO表达降低。因此EPO通过增加颅脑损伤后XIAP表达及减少Smac/DIABLO的表达而起到抗神经细胞凋亡作用,是EPO发挥神经保护作用机制之一。