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胶质瘤是颅内最常见,恶性程度最高的肿瘤。具有侵袭性生长,易复发,肿瘤组织内部细胞异型性的特点。目前的治疗包括手术,放化疗对提高胶质瘤的生存期并没有取得显著性效果。在过去的十年间,胶质瘤的中位生存期依然维持在12个月甚至更少。大量的证据表明除了胶质瘤细胞自身较强的增殖能力和侵袭性,在胶质瘤组织中还存在一群细胞,表现出和神经干细胞相似的特性,即具有无限增殖,自我更新,多系分化的特点,被命名为胶质瘤干细胞。一些研究者认为胶质瘤干细胞具有放化疗抵抗性,是胶质瘤发生以及复发的根源。基于以上观点,寻找新的药物或者分子靶向治疗胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞就显得尤为重要。MicroRNAs是一种内源性的非编码RNA分子,通过与靶mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)的碱基序列完全或部分互补结合清除靶mRNA或者抑制蛋白的合成而发挥其生物学功能。MicroRNAs在转录后水平调节靶基因的表达主要依赖于MicroRNAs与靶基因的互补程度。在植物中,MicroRNAs与靶基因近似结合,导致靶(?)nRNA被切割或者降解。在动物中,MicroRNAs与靶基因完全结合导致了靶蛋白的抑制。生物信息学分析表明人体中至少三分之一的基因被小RNA调控。这些MicroRNAs既可能充当癌基因又有可能充当抑癌基因的作用。近年来发现,大量的MicroRNAs参与了胶质瘤的发病过程。一些microRNAs在胶质瘤增殖,侵袭中发挥了重要作用,比如Let-7, miR-146b等。一些microRNAs在胶质瘤干细胞中增殖,分化,凋亡中发挥着重要作用,例如miR-124,miR-137,miR-451.miR-34a和miR-125b。MiR-107定位于10号染色体10q23.31。先前有研究表明,miR-107在多种肿瘤中异常表达。参与了前列腺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、胰腺癌的发生和发展。然而,有关miR-107在胶质瘤和胶质瘤干细胞中的生物学特性目前并没有得到系统性研究报道。本实验拟探讨miR-107在胶质瘤以及胶质瘤干细胞中的表达情况,研究其对胶质瘤和胶质瘤干细胞增殖,侵袭等生物学特性的影响,并进一步探讨其内在作用机制,为靶向治疗胶质瘤提供新思路。第一部分p53诱导的microRNA-107抑制胶质瘤细胞增殖、下调CDK6和Notch-2的表达目的：研究miR-107在胶质瘤组织及细胞中的表达情况,同时过表达或者抑制miR-107观察其对胶质瘤细胞增殖,细胞周期等影响。探讨p53对胶质瘤细胞miR-107表达的影响,研究miR-107对胶质瘤细胞增殖影响的具体机制。方法：1实时定量RT-PCR检测miR-107在胶质瘤组织(3例WHOⅡ级、4例WHOⅢ级、7例WHOⅣ级)及细胞系(U87,U251和A172)中的表达。2P53质粒的构建和转染。首先扩增p53DNA(上游序列为GCCGGATCCACCATGatggaggagccgcagtcaga,下游序列为GCCGAATTCtcatcagtctgagtcaggccctt)然后将p53DNA克隆进入pcDNA3.1(+)载体。转染的过程如下：1×105个细胞放置在6孔板的每一个孔中,并孵育24小时。根据说明书的指示,用Lipofectamine2000转染细胞,6小时后培养基被完全培养基替代。48小时后应用RT-PCR技术分别检测miR-107在U87,U251和A172胶质瘤细胞系中的表达。3慢病毒的构建和转染。首先合成miR-107前体产物,接着用限制性内切酶EcoR1和BamH1切割miR-107前体产物以及pSIN-EF2-IRES-GFP-puro’漫病毒载体。pSIN-EF2-miR-107-IRES-GFP-puro慢病毒载体合成后,将HEK293包装细胞放置在平板中并转染载体质粒和包装质粒(慢病毒转移质粒(20ug),psPAX2(15ug), pMD2.G (5ug))。72小时候收割上清液,慢病毒的最终浓度为每毫升7.8×107TU。使用Polybrene将慢病毒载体转染到U87和A172细胞。通过抗体分选,大约一周后得到稳定的克隆。实验中所用细胞都分成3组,对照组未进行过任何处理,GFP组转染了慢病毒载体但只含有GFP基因,miR-107组转染了慢病毒载体既含有GFP基因又含有miR-107基因。4细胞增殖使用CCK-8试剂盒检测,转染了Lenti-GFP-miR-107或者Lenti-GFP以及原始的U87和A172胶质瘤细胞以5.0×103每孔的密度放置在96孔板中,每组设置6个副孔。分别孵育6,12,24,48和72小时后每孔加入10微升的CCK-8试剂,然后再分别孵育4小时。应用酶联免疫吸附试验板读数器在450纳米的波段测量每个时间段的分光光度值。细胞增殖抑制率的公式为(AC-AT)/AC×100%,其中AC为空白对照组的吸光光度值,AT为处理组的吸光光度值。实验重复三次。5我们使用PI试剂检测过表达miR-107对细胞周期的影响。转染了Lenti-GFP-miR-107或者Lenti-GFP以及原始的U87和A172胶质瘤细胞消化离心后用PBS冲洗。然后细胞在4℃1000xg的转速下离心3分钟,上清液被丢弃。随后,1毫升PI和10微升的破膜剂在室温下加入到1×106个细胞中。用流式细胞仪检测细胞周期。所有试验重复三次。6转染了Lenti-GFP-miR-107或者Lenti-GFP以及原始的U87和A172胶质瘤细胞的蛋白用RIPA裂解液提取。BCA蛋白试剂盒被用来定量蛋白的浓度。每个泳道添加30μg的蛋白样品,使用SDS-PAGE分离蛋白并将其转移到PVDF膜上。拮抗了非特异性的靶点后,样品在一抗中孵育12小时。然后在对应的二抗中孵育。使用ECL系统观察蛋白印迹,GAPDH作为内源性对照。7采用SPSS13.0统计软件包处理,低级别胶质瘤,高级别胶质瘤以及U87,U251和A172胶质瘤细胞与正常脑组织miR-107表达的差异；各组细胞p53质粒转染前后miR-107表达差异,以及胶质瘤细胞转染miR-107后,miR-107的表达差异用单样本t检验。细胞生长抑制率检测采用析因设计的方差分析。细胞周期检测采用单因素的方差分析(One-way ANOVA),多重比较采用LSD法,所有数据用“均数±标准差”表示,以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1miR-107在胶质瘤组织和细胞系中的表达是下调的,特别是在p53突变的U251和A172胶质瘤细胞中尤为明显。2胶质瘤细胞系转染p53后,miR-107的表达水平上调。3胶质瘤细胞转染Lenti-GFP-miR-107后,用实时定量RT-PCR检测miR-107的表达,发现miR-107的表达显著升高。4U87胶质瘤细胞在转染Lenti-GFP-miR-107后,在6,12,24,48和72小时分别表现出5.33±1.07%,13.08±1.51%,14.24±1.16%,21.22±0.20%和23.72±1.31%的生长抑制,结果显示U87胶质瘤细胞转染Lenti-GFP-miR-107后,细胞增殖能力之间的差异总体有统计学意义(F=47.849,P<0.001)。A172胶质瘤细胞过表达miR-107后,在6,12,24,48和72小时分别表现出10.81±2.17%,13.87±0.85%,17.15±0.27%,18.00±1.41%and21.88±2.07%的生长抑制,结果显示A172胶质瘤细胞转染Lenti-GFP-miR-107后,细胞增殖能力之间的差异总体有统计学意义(F=9.994,P<0.001)。5我们使用PI试剂盒检测过表达miR-107对胶质瘤细胞细胞周期的影响。结果表明在U87细胞中,空白对照组,单纯转染了GFP,以及转染了miR-107的三组细胞在G0/G1期的比例分别是51.42±0.98%,52.66±0.88%和70.37±1.24%,即Control与Lenti-GFP-miR-107组之间差异有统计学意义(F=310.436,P<0.001)。而在A172胶质瘤细胞,过表达miR-107后,处在G0/G1期的细胞由60.64±0.40%上升到77.10±0.74%,Control组与Lenti-GFP-miR-107组之间差异有统计学意义(F=420.855.P<0.001)。6我们使用miRBase(http://www.mirbase.org/)和Target Scan (http://www.targetscan.org/)预测miR-107的靶基因。结果显示CDK6和Notch-2有可能参与了miR-107的调控。应用Western blot检测显示过表达miR-107抑制CDK6和Notch-2蛋白的表达。结论：结果表明miR-107在胶质瘤组织和细胞中表达下调。野生型p53可以转录调控miR-107的表达。此外,过表达miR-107可以抑制胶质瘤细胞的增殖,同时诱使细胞周期阻滞在GO-G1期。同时我们还发现过表达miR-107可以抑制CDK6和Notch-2蛋白的表达,即miR-107可以作为一个潜在的治疗剂靶向治疗胶质瘤。第二部分microRNA-107通过调节Notch2的表达抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭目的：过表达microRNA-107和干扰Notch2基因的表达观察其对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响。进一步研究microRNA-107对靶基因Notch2的调控作用,以及microRNA-107影响胶质瘤细胞迁移和侵袭的内在分子机制。方法：1实时定量RT-PCR检测Notch2,Tenascin-C, MMP-12和Cox-2mRNA的表达(同第一部分)2慢病毒的构建和转染(同第一部分)3Notch2干扰RNA的构建和转染。4细胞迁移实验检测过表达miR-107对胶质瘤细胞迁移影响。首先将转染了Lenti-GFP-miR-107或者Lenti-GFP以及原始的U87和A172胶质瘤细胞以3×105的密度放置在6孔板中,然后在完全培养基中孵育。待细胞密度达到80%时,用10μ1的塑料管在单细胞层上轻轻划一个标准的划痕。然后清除划痕产生的细胞碎屑。继续孵育24小时,用显微镜观察细胞迁移的距离。细胞迁移的距离用划痕的闭合距离来表示。5我们使用matrigel侵袭小室检测miR-107对胶质瘤细胞侵袭能力的影响。首先将3×105转染了Lenti-GFP-miR-107或者Lenti-GFP胶质瘤细胞以及原始的U87和A172胶质瘤细胞重悬在100μl的无血清的培养基中并添加到小室的上层。小室的下层添加600μ1的含有胎牛血清的完全培养基。在37℃孵育24小时后,膜上表面的细胞被去除。小室膜下表面的细胞用4%的甲醛固定,0.1%水晶紫着色。在显微镜下随机挑取5个视野计算穿过膜的细胞数。6为了进一步阐述miR-107抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭机制,我们用qRT-PCR和Western Blot技术检测了与Notch2侵袭相关的基因,如Tenascin-C,MMP-12,和COX-2。qRT-PCR方法同前,Western Blot检测如下,具体为将转染了Lenti-GFP-miR-107或者Lenti-GFP以及原始的U87和A172胶质瘤细胞的蛋白用RIPA裂解液提取。用BCA蛋白试剂盒定量蛋白的浓度。每个泳道添加301μg的蛋白样品,使用SDS-PAGE分离蛋白并将其转移到PVDF膜上。拮抗非特异性的靶点后,样品在一抗中孵育12小时。然后在相应的二抗中孵育。使用ECL系统观察蛋白印迹,GAPDH作为内源性对照。7采用SPSS13.0统计软件包处理,RNA干扰和RNA干扰后侵袭实验,两样本均数的比较均采用两独立样本的t检验(independent-samples Ttest);荧光定量PCR检测各种基因的表达采用单样本的t检验,体外侵袭实验、划痕实验采用单因素方差分析(One-way ANOVA),多重比较采用LSD法,数据用“均数±标准差”表示,以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1MiR-107抑制了胶质瘤的迁移和侵袭。划痕后24h,转染了miR-107的U87和A172胶质瘤细胞迁移距离与空白对照组相比分别减少了33%(Control组与Lenti-GFP-miR-107组之间差异有统计学意义(F值=140.296,P<0.001))和25%(Control组与Lenti-GFP-miR-107组之间差异有统计学意义(F值=16.486,P=0.002))。侵袭试验中,过表达miR-107的U87和A172胶质瘤细胞与空白对照组相比穿膜细胞数分别减少了45%(Control组与Lenti-GFP-miR-107组之间差异有统计学意义(F值=127.377,P<0.001)和47%(Control组与Lenti-GFP-miR-107组之间差异有统计学意义(F值=333.576,P<0.001))。2干扰胶质瘤细胞Notch2的表达抑制了胶质瘤细胞的侵袭。对Notch2基因敲除后,U87和A172胶质瘤细胞的侵袭能力分别呈29%((t值=3.705,P=0.021))和22%((t值=7.225,P=0.002))的降低。3RT-PCR和、vestern-blot结果显示过表达MiR-107抑制与侵袭相关的分子如Tenascin-C, MMP-12,和COX-2的表达。结论：MiR-107在胶质瘤细胞中表达是下调的,过表达MiR-107可以抑制胶质瘤的迁移和侵袭。此外,miR-107参与调节Notch2/Tenascin-C/MMP-12和Notch2/Cox-2途径。miR-107发挥其抗侵袭作用很大程度上是通过调节Notch2途径实现的。综合以上结果表明miR-107可以作为一个潜在的治疗靶点治疗胶质瘤。第三部分microRNA-107抑制U87胶质瘤干细胞生长和侵袭目的：检测microRNA-107在CD133+胶质瘤干细胞中的表达,过表达microRNA-107对胶质瘤干细胞增殖和侵袭的影响以及其内在的调控机制。方法：1CD133+的胶质瘤细胞的分选和纯化。107个原代胶质瘤细胞,U87和A172胶质瘤细胞在40C的环境下标记10μlCD133/2(293C3)流式分选抗体,整个过程避光持续10分钟,鼠IgG2b单克隆抗体作为内对照。标记结束后在流式细胞分选仪上分选CD133+的胶质瘤细胞。分选后的细胞再标记上CD133/1抗体,在流式细胞仪上检测其CD133+阳性的比率。2实时定量RT-PCR检测niR-107、CD133、Nestin、MMP-2、MMP-9和MMP-12mRNA的表达。(同第一部分)3慢病毒的构建和转染(同第一部分)4神经球的培养和增殖能力检测。将2×105个转染了miR-107的CD133+U87胶质瘤细胞和对照组细胞放置在24孔板中。所有细胞均重悬在无血清培养基中,其中培养基的种类为DMEM/F12,添加的细胞因子分别为bFGF,EGF和B27,72后可观察到神经肿瘤球的出现。考虑到CD133+胶质瘤细胞在无血清培养基中可以形成神经球,我们同时通过检测神经球的数量和直径,来评估miR-107对CD133+胶质瘤细胞增殖的影响。即挑取任意3-5个视野,计数肿瘤球的数量和测量肿瘤球的直径。5BD Matrigel侵袭小室用来检测miR-107对胶质瘤干细胞侵袭能力的影响,转染了miR-107或者单纯转染了GFP的细胞被重悬在100μl的无血清培养基中并添加到小室的上层。小室的下层添加600m的含有胎牛血清的完全培养基。在37℃孵育24小时后,膜上表面的细胞被去除；在膜下表面的细胞用4%的甲醛固定,0.1%水晶紫着色。在显微镜下随机挑取3个视野并计算穿过膜的细胞数。考虑到CD133+胶质瘤细胞具有成球的能力,本实验也通过测量神经球细胞迁移的距离评估其侵袭能力,具体过程为：挑选具有相似大小的神经球,并将其放置在24孔板中,提前在孔板底面添加1%多聚赖氨酸以保证细胞粘附贴壁,24小时候后,计算神经球周围放射状细胞迁移的距离。6转染了Lenti-GFP-miR-107或者Lenti-GFP CD133+U87胶质瘤细胞的蛋白用RIPA裂解液提取。BCA蛋白试剂盒定量蛋白的浓度。每个泳道添加30μg的蛋白样品,使用SDS-PAGE分离蛋白并将其转移到PVDF膜上。拮抗非特异性的靶点后,样品在一抗中孵育12小时。然后在相应的二抗中孵育。使用ECL系统观察蛋白印迹,GAPDH作为内源性对照。7采用SPSS13.0统计软件包处理,RT-PCR检测CD133,Nestin,MMP-2,MMP-9和MMP-12表达的差异采用单样本的t检验。肿瘤干细胞增殖能力和侵袭能力的差异采用独立样本的t检验分析,数据用“均数±标准差”表示,以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1通过荧光激活的流式细胞分选,成功获取了CD133+和CD133-的胶质瘤细胞。应用流式细胞仪对分选细胞纯度进一步检测显示,分选后CD133+的胶质瘤细胞相对于分选前分别从7.2%到85.4%,1.1%到80.5%,1.2%到63.7%。实时定量RT-PCR对miR-107在CD133+和CD133-胶质瘤细胞中的表达进一步检测提示,相对于CD133-胶质瘤细胞,CD133+的胶质瘤细胞miR-107表达下调了2-4倍,即miR-107可能在胶质瘤干细胞的生物学特性中发挥着重要作用。2神经球的数量和直径检测结果表明：与对照组相比,过表达miR-107导致了29%(Lenti-GFP组和Lenti-GFP-miR-107形成肿瘤球数量之间的差异有统计学意义(t值=3.592,P值=0.023))的神经球数量的减少和22%(Lenti-GFP组和Lenti-GFP-miR-107形成肿瘤球直径之间的差异有统计学意义(t值=2.828,P值=0.047))神经球直径的降低。我们进一步研究导致神经球数量的减少和神经球直径的降低的内在分子机制,发现过表达miR-107可以抑制Notch2,CD133和Nestin的表达。3BD Matrigel侵袭小室实验结果表明：过表达miR-107使得胶质瘤干细胞穿膜细胞数减少了28%(转染了Lenti-GFP的CD133+U87胶质瘤细胞与转染了Lenti-GFP-miR-107后的CD133+U87胶质瘤细胞穿膜细胞数之间的差异有统计学意义(t值=4.013,P值=0.016))。神经球周围细胞迁移距离实验同样表明：过表达miR-107可以抑制肿瘤干细胞的侵袭。我们进一步探究其内部的分子机制,数据提示miR-107可能通过抑制Notch2表达进而抑制MMP-12的表达,而常见的在胶质瘤和胶质瘤干细胞侵袭中发挥重要作用的MMP-2和MMP-9在胶质瘤干细胞过表达miR-107后并没有发生明显变化。结论：miR-107在胶质瘤干细胞中的表达呈下调状态。过表达miR-107,可抑制Notch2蛋白和干细胞标志物CD133、Nestin的表达。过表达miR-107亦可抑制U87胶质瘤干细胞的侵袭,并减少了基质金属蛋白酶-12(MMP-12)的表达。实验结果提示,miR-107参与了胶质瘤干细胞的增殖和侵袭,可将其考虑为胶质瘤治疗的潜在靶点。