【摘 要】
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该研究包括五个方面的内容.烟草花药绒毡层特异启动子TA29、解淀粉芽孢杆菌bar-nase和barstar基因的克隆、抗除草剂PPT的bar基因的亚克隆与全序列分析;barnase基因的 修饰;雄
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该研究包括五个方面的内容.烟草花药绒毡层特异启动子TA29、解淀粉芽孢杆菌bar-nase和barstar基因的克隆、抗除草剂PPT的bar基因的亚克隆与全序列分析;barnase基因的 修饰;雄性不育嵌合基因和育性恢复嵌合基因植物表达载体的构建;农杆菌LBA4404介导的 番茄遗传转化;运用RAPD技术鉴定番茄杂种纯度的随机引物的筛选、特异扩增的克隆、测序、特异扩增引物的设计合成、特异扩增及转基因植株花粉败育率的测定.通过PCR扩增和克 隆,获得了烟草花药绒毡层特异启动子TA29、解淀粉芽孢杆菌的barnase和barstar基因、抗除草剂PPT的bar基因.鉴于细菌基因中的碱基A和T含量较G和C含量高,而高等植物中G和C含量高于A和T,以及当一个密码子的头两个碱基与反密码形成AU配对时,则第三个碱基优先使用C(生成GC配对)而不使用U(生成AU对)使之结合更紧密这两方面的原因,对barnase基因进 行了部分核苷酸的修饰.pNR29和pMN29均为雄性不育嵌合基因植物表达载体,前者带有barnase基因,后者为M-barnase基因,pSR29表示含有barstar基因的育性恢复嵌合基因植物载体,它们的启动子均为TA29.载体上的bar基因为筛选标记基因,启动子为CaMV 35S.番茄S2 和G6品种对除草剂丝裂菌素(Phosphinothricin,PPT)的敏感程度差异不大.PPT浓度为0.75mg/L时,叶盘黄化,向乎不形成愈伤;1.0mg/L的PPT使番茄植株不能生根和生长.通过320 个随机引物的筛选,发现引物OPH14能在G6和S2*G6中扩增出S2没有的特异DNA片段,并对该 片段进行了克隆和测序.采用SPA和SPB的特异扩增对转基因植株B、TA和TB的花粉败育率进 行了测定.初步说明近10年百分点的提高是因为转基因植株中M-barnase基因的翻译水平比barnase基因高的结果.
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