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MiRNA--TAS--ta-siRNA--target gene级联途径是基因调控网络的重要组分,在植物发育和环境胁迫响应过程中具有重要调节作用。本研究在桑树中鉴定到一种新的ta-siRNA合成级联途径:Mul-miR3954--MuLnc1--ta-siRNA--Mul-CML27,分析了该途径中各组分的表达模式和生物功能,在此基础上通过转基因和植物杂交技术在拟南芥中建立了Mul-miR3954--MuLnc1--ta-siRNA级联途径,并对其生物功能和作用机制进行了探讨,为全面揭示桑树Mul-miR3954--Mu Lnc1--ta-siRNA--target gene级联途径的生物功能和作用机制奠定了基础,对于丰富植物ta-siRNA合成级联途径,促进桑树功能基因组学研究具有重要意义。本文的主要研究结果如下:(1)桑树Mul-miR3954--MuLnc1--ta-siRNA--target gene级联途径的鉴定通过对桑树转录组、sRNA和降解组数据库分析发现,桑树mul-miR3954可以靶向一种长链非编码RNA Mu-Lnc1的转录本,切割其产生多个以21 nt为单位的相变的siRNAs,即潜在的ta-siRNAs。利用Northen Blot技术在桑树中检测到了相关siRNAs的积累,进而证明mul-miR3954--MuLnc1--ta-siRNA级联途径的存在,表明Mu-Lnc1可能是桑树中的一种新的TAS。(2)Mul-MIR3954基因的克隆及功能分析利用PCR技术克隆得到了Mul-MIR3954基因,定量PCR分析发现mul-miR3954在桑树根中的表达量最高,而在桑椹中的表达量最低,在不同组织或器官中表达量差异显著。将Mul-MIR3954转入拟南芥并获得了转基因植株,通过Northern Blot和定量PCR分析发现Mul-MIR3954基因能在转基因植株中高效表达,加工产生mul-miR3954成熟体。表型分析发现转Mul-MIR3954在拟南芥中表达可以促进植株根系生长。与野生型拟南芥相比转基因植株对丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000)侵染、干旱和盐分胁迫的敏感性增强。因此,Mul-MIR3954基因可能对植物的生长发育具有调节作用,同时在植物对Pst DC3000侵染、干旱和盐分胁迫的响应过程中对植物的抗性起到负调控作用。(3)MuLnc1基因的克隆及功能分析利用PCR技术克隆得到了MuLnc1基因,分析发现该基因在不同物种间保守性较差,在桑树中该基因在桑椹中的表达量最高,而在树皮中的表达量最低,在不同组织或器官中表达量也有明显差异。将MuLnc1基因转入拟南芥并获得了转基因植株,分析发现MuLnc1基因能在转基因植株中高效表达。表型分析发现转MuLnc1在拟南芥中表达可以促进植株生长,与野生型拟南芥相比转基因植株对Pst DC3000侵染、干旱和盐分胁迫的抗性增强。因此,MuLnc1基因表达可能促进植物的生长发育,同时增强植物对Pst DC3000侵染、干旱和盐分胁迫的抗性。(4)桑树钙调素类似蛋白基因CML27的克隆以及功能分析利用PCR技术克隆得到了桑树钙调素类似蛋白基因CML27(命名为Mul-CML27),该基因编码区全长为507 bp,编码蛋白有168个氨基酸,理论分子质量为18.5 kDa,等电点为4.38,是由无规则卷曲连接α螺旋折叠而成。该蛋白不含有跨膜结构域和信号肽,具有两个钙调蛋白共有的EFh超级家族结构域和多个磷酸化位点。在桑树中Mul-CML27基因在桑树桑椹和根中的表达量较高,而在叶和树皮中的表达量较低。将Mul-CML27基因转化拟南芥成功获得了转基因植株。相比野生型植株转基因拟南芥株型较小,但根系较长,植株对Pst DC3000、干旱和盐分胁迫具有较强的抗性。(5)Mul-miR3954-Mu Lnc1-ta-siRNA级联途径功能分析以转MuLnc1基因拟南芥为母本,转Mul-MIR3954基因拟南芥为父本进行杂交,获得了F1杂交苗。通过Northern blot和定量PCR分析在杂交苗中检测到Mul-MIR3954和MuLnc1基因的表达以及由mul-miR3954切割MuLnc1转录本产生的次级siRNA si161579的积累,表在杂交苗中建立起了Mul-miR3954-MuLnc1-ta-siRNA级联途径。杂交苗对Pst DC3000侵染、干旱和盐分胁迫的抗性与野生型植株相比没有明显差异,进一步表明mul-miR3954可以靶向切割MuLnc1转录本,桑树中的mul-miR3954-MuLnc1-ta-siRNA级联可能负调控植物对环境胁迫的抗性。