【摘 要】
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弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的机会致病原虫(opportunisticprotozoan),能感染几乎所有恒温动物(包括人类),引起弓形虫病。在免疫功能正常的宿主体内通常
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弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的机会致病原虫(opportunisticprotozoan),能感染几乎所有恒温动物(包括人类),引起弓形虫病。在免疫功能正常的宿主体内通常形成包囊,造成隐性感染;对于免疫功能下降的宿主(如肿瘤患者、器官移植者及AIDS患者等),可引起严重的临床症状甚至导致宿主死亡。弓形虫膜表面蛋白1(SAG1)是弓形虫速殖子期的特异性抗原,具有很强的免疫原性,是弓形虫诊断和疫苗研究的重要候选抗原分子。SAG1在原虫中含量较低,利用基因工程技术在体外表达蛋白可以获得大量高纯度SAG1。本研究根据已发表的SAG1基因序列设计特异性引物,以弓形虫基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增出SAG1基因的主要抗原片段P30(S),构建T-A克隆,经PCR扩增和酶切鉴定后进行测序。将正确的P30(S)基因片段亚克隆入pET-28a(+)原核表达载体中,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达得到重组蛋白P30(S)。纯化后的P30(S)经SDS-PAGE与Western-blot验证,该融合蛋白分子量大小介于26-35kD之间,符合预期大小;可与大鼠弓形虫病阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性,可以作为抗原检测大鼠弓形虫病血清抗体。以纯化的P30(S)作为包被抗原,经试验确定最佳抗原包被浓度、血清和酶标抗体稀释浓度,建立大鼠弓形虫病抗体间接ELISA检测方法。通过特异性试验、敏感性试验、稳定性试验以及对比试验,表明本研究建立的间接ELISA方法特异性强、敏感度高、重复性好,为试剂盒的研制与开发奠定了基础。
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