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微生物多糖因其来源广、易分离从而更受研究者的关注,特别是海洋微生物,其非常庞大的种类、数目,以及特有的高盐浓度、高压、高温差、寡糖等与陆地相差甚远的生活环境,造就了很多多糖具有不同的生物学活性,如免疫学活性、抗肿瘤活性、抑菌活性及抗氧化活性等。其中又以微生物胞外多糖的研究更甚,它具有产量高、性质稳定、易与菌体分离等特点。微生物胞外多糖包括黏附在其表面的荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)和合成后分泌到环境介质中的胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)。本论文研究目的在于筛选产胞外多糖的海洋细菌,并进一步研究所获得的胞外多糖的免疫学活性,旨在为该多糖的进一步利用奠定基础。研究首先通过苯胺兰LB固体培养基从取自北海和钦州两地的近海水样和茅尾海红树林泥样中进行产胞外多糖菌的初筛,然后用常规发酵培养基进行复筛,最终获得两株产胞外多糖产量较好的菌株,分别命名为QLc-04和BHc-09。16Sr DNA的序列比较表明,QLc-04菌属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.),而BHc-09菌属于弧菌属(Vibrio sp.)。随后对这两株菌的产胞外多糖的发酵条件中的碳源、氮源、无机金属离子进行了优化。优化结果为:QLc-04菌的最佳发酵条件为1L发酵液中加入乳糖6g、酵母粉4.5g、Zn2SO40.05g,BHc-09菌最佳发酵条件为1L发酵液中加入淀粉6g、酵母粉4.5g、Mg2SO40.05g。在优化后的条件下,经过30℃、180r/min发酵36h后,QLc-04菌胞外多糖(即04多糖)产量可达到0.4759mg/m L,BHc-09菌胞外多糖(即09多糖)为0.4917mg/m L。随后对04多糖和09多糖进行了初步理化性质分析,通过红外光谱分析结果表明,两种多糖都有多糖的特征吸收峰,并且BHc-09菌的胞外多糖中还具有糖醛酸的吸收峰,可以判定04多糖和09多糖为不同的胞外多糖。运用高效液相色谱测定04多糖的分子质量约为179.9KDa,09多糖的分子质量约为184.5KDa。最后通过扫描电镜可以看到,04多糖呈现不规则球状,而09多糖呈现条状或扁平状。本研究还通过小鼠T、B淋巴细胞体外增殖及巨噬细胞吞噬中性红等几个方面研究了04多糖和09多糖的体外免疫学活性,并检测了04多糖和09多糖对体外培养的Hela肿瘤细胞的抑制作用。结果,04多糖和09多糖均具有促进小鼠T、B淋巴细胞增殖和促进巨噬细胞吞噬功能的作用,其中04多糖促进B细胞的体外增殖效果好于其对T细胞的体外增殖,对小鼠胸腺T细胞的增殖作用在多糖浓度为100μg/m L时达到最大,而对B细胞的增殖作用是随多糖浓度增大而增强;09多糖对T、B细胞体外增殖作用相当,都随浓度增大而增强。04和09多糖在浓度都达到50μg/m L时,对巨噬细胞吞噬中性红的作用达到最大,之后有减弱趋势,但依然高于对照组。体外肿瘤细胞抑制实验证实,04多糖和09多糖均具有抗肿瘤细胞增殖活性,体外能够明显抑制肿瘤细胞的增殖,并随多糖浓度增大抑制作用增强,其中09多糖所显示的效果更好。最后,以商品鸡中鸡传染性法氏囊病(Infectious dorsal disease,IBD)的免疫和攻毒为模型评价04多糖和09多糖在动物体内的免疫增强作用。结果显示,免疫了IBD病毒(IBDV)B87商品疫苗并注射了04多糖和09多糖的实验组雏鸡体内分泌抗IBDV抗体水平和IL-1数量要明显高于只免疫B87没有注射多糖的实验组,而只注射04多糖和09多糖的实验组分泌的IL-1水平也要高于空白组。IBDV的免疫保护性实验结果表明,超强毒力株IBDV(vv IBDV)攻毒后,攻毒对照组发病率为100%,死亡率为12.5%,而B87免疫组则出现30%的发病率,B87联合04多糖和09多糖实验组发病率均为20%,明显低于仅免疫B87的实验组,免疫器官指数显示,B87免疫组的法氏囊和胸腺略微有萎缩现象,而B87联合04多糖和09多糖的实验组的法氏囊和胸腺属于正常,说明04多糖和09多糖能够修复由于免疫活苗而给免疫器官造成的损伤。流式检测结果、荧光定量PCR检测结果的趋势与上述结果一致。这些结果表明,04多糖和09多糖能够增强雏鸡的自身免疫能力,并且在与B87疫苗联合使用后能够提高雏鸡对vv IBDV的攻毒保护性。综上所述,本研究所筛选的QLc-04菌(Bacillus sp.)和BHc-09菌(Vibrio sp.)经过培养条件的优化,具有较高的产胞外多糖能力,两种多糖均具有良好的免疫学活性。本研究结果为进一步研究北部湾海域产活性胞外多糖海洋细菌及该类细菌多样性奠定了基础,筛选出的活性多糖也为今后相关疾病的免疫增强方案的制定提供理论和物质基础。