基于光学读出的微悬臂梁生化传感技术研究

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微悬臂梁生化传感技术是近年发展起来的新兴技术。当有生化反应在微悬臂梁的单侧表面发生时,其表面应力的改变会导致微悬臂梁产生弯曲变形,通过光学或电学读出方法可以测量变形值。由于其具有大比表面积,表面效应强,容易实现阵列集成等优点,为生化传感器的研究提供了新的思路,成为研究的热点。本文以微悬臂梁生化传感技术发展的两大核心——提高检测灵敏度和高通量检测为出发点,对基于光杠杆原理的单悬臂梁检测系统进行改进,利用改进后的实验系统研究了大分子在界面的自组装过程以及在不同的抗体修饰方法下,抗原抗体的特异性结合,并提出了两种微悬臂梁阵列检测的方案。通过使用聚焦处半径较小的激光器,稳定激光器的输出强度,使实验系统的可重复性得到提高。通过实验和理论分析,在反射光路中加入凸透镜以及优化微悬臂梁尺寸,可以使系统检测灵敏度分别提高4倍和20倍。通过使用高精度的恒温器(温控精度±0.01K),消除了微悬臂梁的热变形影响,同时使本底噪音保持在合理的范围,而且确保样品温度和容器池的温差不会对系统检测造成影响,提高了系统的信噪比。通过对传统光路参数的理论分析,得到在特定的光路参数下,可以完全消除溶液折射率改变对系统检测的影响,而且不改变系统的检测灵敏度。理论分析得到实验结果的验证。利用溶液折射率变化对系统检测的影响,提出了一种通过检测液体折射率来检测液体浓度的方案。研究了不同分子量的巯基化的聚N-异丙基丙烯酰胺(HS-PNIPAM)在金表面自组装的动力学过程。实验结果表明HS-PNIPAM在自组装过程中存在三个阶段,分别对应不同的分子构象。第一阶段为物理吸附阶段,第二、三阶段为伴随着分子构象变化的化学吸附阶段。化学吸附曲线符合Langmuir等温吸附。分析结果还显示HS-PNIPAM的表面吸附速率κ远小于小分子的吸附速率,并与分子量成负指数关系;HS-PNIPAM的自组装时间远大于小分子的自组装时间,并与分子量成正比;底物表面应力的改变与分子量成正线性关系。研究了在三种抗体修饰方法下,抗原抗体的特异性结合。将抗体修饰在微悬臂梁的金面,检测不同浓度的标准样品下微悬臂梁的弯曲变形,包括抗体巯基化修饰方法检测瘦肉精、SPA修饰抗体的方法检测瘦肉精和氯霉素以及二抗修饰抗体的方法检测青蒿素和马兜铃酸。抗体的活性以及在微悬臂梁上进行抗原抗体结合的可行性得到了ELISA实验的验证。实验结果表明:抗原抗体的结合具有很强的选择性。结合产生了压应力,且与浓度成正比。二抗修饰方法是三种方法中效果最差的,检测极限比标准曲线对应的IC20低于两个数量级。SPA修饰方法与巯基化修饰方法的检测效果大体一致,检测极限都要优于1ng/ml,与标准曲线对应的IC20相当。分析认为,检测极限与抗体活性和抗原抗体结合位置到微悬臂梁表面的距离有直接的关系。提出了两种检测微悬臂梁阵列变形的光路方案。第一,在UC Berkeley的光路基础之上进行改进,将偏振光引入检测系统,通过对光束偏振态的控制,降低了测量信号的背景噪声,提高了系统信噪比;通过对微悬臂梁的优化设计(初始转角和反光板),提高光学检测灵敏度。第二,将光学滤波方法引入到生化检测当中。
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