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目的︰以东北红豆杉(T.cuspidata)的茎培养愈伤组织,研究了6-BA浓度、NAA浓度、2,4-D浓度、采样季节和光照条件对东北红豆杉茎段形成愈伤组织中紫杉醇含量的差异,研究了愈伤组织的生长动态和紫杉醇积累的动态,以及影响愈伤组织生长和生产紫杉醇的一些因素。 以人肝癌HepG2细胞系作为体外模型,研究紫杉醇和三尖杉宁碱联合应用对人肝癌HepG2细胞株凋亡的诱导作用,并且深入探讨其作用机制,从而为紫杉醇和三尖杉宁碱联合应用于临床治疗肝癌提供更坚实的实验基础和理论依据,为肝癌的化学药物治疗探索出一条新的途径。 方法︰借用最新代谢分析思路,从整体性和动态性出发,分析在植物生长调节剂、光照和温度作用下的东北红豆杉愈伤组织体系中紫杉烷代谢谱变化,结合相关关键基因的变化,探讨紫杉醇生物合成的关键代谢步骤和调控机制。调查归纳东北红豆杉植株中紫杉烷的生物合成、代谢和积累的规律。获得了一年四季植株紫杉烷代谢特征谱。 MTT法检测不同浓度单药紫杉醇、单药三尖杉宁碱及联合紫杉醇与三尖杉宁碱不同给药方案对HepG2细胞的生长抑制作用;AnnexinV-FITC/PI染色法分析不同联合给药方案对HepG2细胞凋亡的影响;PI染色法分析不同给药方案对HepG2细胞周期分布的影响。 结果︰植物生长调节物质在愈伤组织生长和代谢过程中起着重要的作用。高浓度的NAA不利于紫杉醇的合成,而降低NAA的浓度对愈伤组织的生长影响较小。当2,4-D与6-BA激素浓度为1:0.05时,紫杉醇含量明显增高,而生长率仅稍有降低。因此,选用2,4-D浓度为1.0mg·L-1,6-BA浓度为0.05mg·L-1作为细胞生产紫杉醇的激素组合。在培养周期中,光照对愈伤组织的诱导、生长和紫杉醇的合成有明显的抑制作用。 不同浓度的紫杉醇与三尖杉宁碱联合组对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用均强于紫杉醇或三尖杉宁碱单用药组,AnnexinV-FITC/PI染色结果显示联合用药组可检测到大量的凋亡人肝癌细胞,明显多于单用药组。紫杉醇与三尖杉宁碱联合应用于人肝癌细胞HepG2细胞可协同抑制其增殖,并可明显诱导凋亡发生。 结论︰以东北红豆杉当年生嫩茎作为外植体,以B5培养基为基本培养基,通过正交设计筛选出的诱导培养基的激素方案为NAA浓度1.0mg·L-1,6-BA浓度0.05mg·L-1,2,4-D浓度1.0mg·L-1。 本研究用MTT法证实两药联合有协同作用,AnnexinV-FITC/PI双染法亦证实联合给药明显较单药组凋亡细胞数目多。同时本研究发现紫杉醇与三尖杉宁碱以不同方式联合后对HepG2细胞的抑制率不相同,只有先给予紫杉醇在给予三尖杉宁碱可以起到协同作用,同时也证实了细胞凋亡通常是在紫杉醇与三尖杉宁碱联合作用的一定浓度和作用时间内发生的,超出最高界线则表现为细胞坏死。