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人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)是牙龈组织中主要的感受性细胞和效应性细胞,体外HGFs的形成及功能会受机械性应力的影响,生物学行为的变化及变化机制尚不明确。既往研究仅从单一分子或基因水平上对HGFs的分子生物学机制进行研究,无法从整体、动态层面了解HGFs在机械性应力作用下相关调控基因和功能蛋白产物的变化规律。蛋白质组学研究方法的成熟应用,为我们研究HGFs生物学行为的变化机制提供了新的技术手段和研究思路。本研究采用四点弯曲细胞应力加载系统,对体外培养的HGFs细胞系加载2000μ strain周期性单轴压应力,作用时间分别为3h,6h,12h及24h,采用免疫细胞化学、CCK-8、BCA法蛋白定量分析、蛋白质双向电泳、生物质谱等方法检测周期性单轴压应力对HGFs细胞增殖活性的影响,寻找出HGFs增殖活性最高的压应力加载时相,同时进行蛋白质双向凝胶电泳分析,发现差异蛋白质点并对其进行质谱鉴定。研究内容如下：1.周期性单轴压应力对HGFs增殖能力的影响目的：研究周期性单轴压应力对HGFs增殖能力的影响。方法：体外成功培养HGFs细胞系,采用四点弯曲细胞应力加载系统,分别在不同的刺激时相((3h,6h,12h,24h),用2000μ strain大小的应力对HGFs进行加力。采用CCK-8法检测周期性单轴压应力对HGFs增殖能力的影响。结果：2000μ strain周期性单轴压应力作用3h后,人牙龈成纤维细胞增殖能力没有明显变化,但随着时间的延长,6h细胞的增殖活性逐步加强(P<0.05),12h压应力刺激后HGFs光密度值(0D)最高,达到为0.701±0.035,提示HGFs进入增殖高峰(P<0.01)。结论：2000μ strain周期性单轴压应力加载12h后,HGFs增殖能力达到最大。2.周期性单轴压应力刺激HGFs后差异蛋白质的质谱分析目的：研究周期性单轴压应力刺激HGFs后蛋白质双向凝胶电泳表达的差异。获得差异蛋白质点的肽质量指纹图谱,进行质谱鉴定,根据鉴定结果推测HGFs受到机械压应力后这些差异蛋白质发挥的生物学作用。方法：采用四点弯曲细胞应力加载系统,根据实验1结果,选择2000μ strain大小的压应力加载12h的HGFs为加力组,以正常细胞作为静态组。分别对加力组和静态组的细胞进行裂解、BCA法蛋白质定量检测,蛋白质双向凝胶电泳,凝胶硝酸银染色,应用凝胶分析软件ImageMaster2D对蛋白质点进行分析。此外,对差异蛋白质点进行原位酶解后制备样品,脱盐,使用MALDI-TOF质谱仪进行分析,将获得的蛋白质肽质量指纹谱数据通过Mascot搜索引擎在NCBI数据库中进行检索,并确定出蛋白质的各种信息。结果：加力组和静态组分别得到607±15和586±19个蛋白质点。总蛋白质点在HGFs受到压应力后显著增加。经MALDI-TOF质谱仪分析,获得了7个差异蛋白的肽质量指纹图谱,蛋白数据库检索,成功鉴定出α-烯醇化酶、核糖体再循环因子、波形蛋白、α2-巨球蛋白、泛素羟基末端水解酶、延伸因子1、透明质酸酶7个差异蛋白质。按照功能分类,大致与以下生物活动相关：应激反应,能量代谢,细胞增殖,细胞骨架重建,信号转导。结论：1.通过蛋白质双向凝胶电泳技术结合硝酸银染色,可以得到HGFs加载压应力后分辨率较高、可重复性较好的差异蛋白质谱,为进一步进行质谱鉴定奠定了良好的基础；2.通过差异蛋白质组学研究,发现了周期性单轴压应力作用下,调控HGFs生物学行为的7个有意义的关键蛋白质,并推测了这些蛋白质在牙龈组织改建中的作用。