叶点霉发酵液中蒽醌类物质的分离提取及其生物活性的初步研究

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植物大黄的地上叶片部分中存在着一种内生真菌——叶点霉菌,该真菌的发酵产物中含有蒽醌类物质。蒽醌类物质具有一定的生物活性,如抗菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤活性等。蒽醌类物质在植物体中的存在形式主要分为两种,一是游离型的蒽醌类物质,二是游离型蒽醌类物质与葡萄糖等结合形成的苷类。本文主要对叶点霉发酵液中总蒽醌类物质的提取方法进行研究,并运用正交实验设计法对总蒽醌类物质的提取条件进行优化,确定的最佳工艺条件为:发酵天数为20d,有机萃取溶剂为氯仿,液料比为50:1,在此实验条件下进行提取,测得叶点霉发酵液中总蒽醌类物质的平均得率为23.96mg/g。采用醋酸镁显色法对氯仿提取物进行显色,并用分光光度计对其吸光度进行检测,叶点霉发酵液中总蒽醌类物质含量的标准曲线的线性回归方程为:y=23.00x+0.015,R2=0.997,总蒽醌类物质的含量在0.001-0.025mg/mL范围内呈良好的线性关系,从而建立了叶点霉发酵液中总蒽醌类物质的定量测量方法,该方法的验证实验结果显示,对于检测叶点霉发酵液中总蒽醌类物质含量,该方法具有良好的精密度、重现性和稳定性,且加样回收率高,检测结果准确,可以满足后续实验的需要。应用层析技术对氯仿提取物中的总蒽醌类物质进行分离纯化,采用红外光谱及核磁共振方法对纯化产物的结构进行确认,经解析,并结合文献数据,对该纯化产物的波谱数据进行了归属,确定了该纯化产物的结构,确定该纯化产物为大黄酸(1,8-二羟基-3-羧基蒽醌)。以实验中制得的大黄酸为对照品,采用高效液相色谱(HPLC)的方法,建立该大黄酸的标准工作曲线,从而建立一种检测叶点霉发酵液中生物活性物质的定性定量方法。研究了叶点霉发酵液中大黄酸的生物活性,分别对其抗菌活性、抗炎活性以及抗氧化活性进行了验证实验。抗菌实验结果显示,叶点霉发酵液的氯仿提取物对四种指示菌有明显的抑制效果,特别是对副伤寒杆菌的抑制作用最为明显。抗炎实验结果显示,选择浓度为15mg/L的大黄酸为安全剂量时,LPS能够诱导RAW264.7细胞释放NO,而大黄酸对LPS刺激下的RAW264.7细胞释放NO的功能由明显的抑制作用。通过DPPH自由基清除活性、还原力以及抑制脂质体过氧化活性实验,对大黄酸的抗氧化活性进行评价,实验结果显示,大黄酸具有一定的DPPH自由基清除能力和还原力,并具有很强的抑制脂质体过氧化活性,显示大黄酸具有一定的抗氧化活性。
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