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【研究背景和目的】慢性痛被定义为在多种病理条件下,由持续的组织炎症或神经损伤引起的神经表观遗传学疾病,并伴有从基因调节到突触功能障碍和情绪障碍等持久的、多方面的适应不良反应。炎症、组织或神经损伤导致的脊髓背根神经节、脊髓背角和疼痛相关脑区感觉神经元基因表达的改变,被认为参与慢性痛的发生发展。这些变化是如何发生的?人们一直在努力寻找影响这些基因表达的调控机制。表观遗传学修饰,包括DNA甲基化、组蛋白修饰和小分子核糖核酸,被广泛证实可有效地调控基因的表达。表观遗传学改变可能会持续数年甚至数代,参与调控慢性痛条件下的疼痛超敏反应。中枢敏化在慢性痛的发生发展中发挥重要作用,它与躯体感觉皮质、岛叶皮质和前扣带回皮层（Anterior cingulate cortex,ACC）的分布结构群的激活有关。ACC在疼痛研究中受到越来越多的关注,已证实ACC在疼痛调节、学习、记忆和注意力等方面发挥着关键作用。多种机制影响慢性痛的中枢敏化过程。其中,神经炎症信号作用于中枢神经系统（Central nervous system,CNS）,引起包括神经递质传递、神经内分泌功能和神经可塑性的变化,导致大脑痛觉敏化,成为慢性痛发生发展至关重要的因素。我们课题组之前的研究也证实,小鼠ACC区突触兴奋性神经递质释放增加导致慢性炎性痛的发生。另有研究表明,中枢敏化与CNS中处理痛觉信号的细胞内基因异常的表达有关。肝X受体（Liver X receptors,LXRs）是核受体超家族的一种转录因子,包括LXRα（即NR1h3）和LXRβ（即NR1h2）,具有调节细胞和全身胆固醇稳态的重要功能,其在CNS中的重要作用日益受到关注。LXRα主要表达在脂类代谢相关的器官,而LXRβ广泛表达于全身各系统,并在免疫系统和CNS中发挥重要作用。敲除LXRα基本不引起小鼠的发育缺陷,而敲除LXRβ则导致大脑皮质构筑紊乱、黑质多巴胺能神经元丢失、焦虑等行为异常。此外,LXRβ在脊髓中亦有表达,雄性LXRβ-/-小鼠表现出成熟运动神经元退化,而激动剂T0901317通过激活LXRβ发挥脊髓保护的作用。GW3965是另一种人工合成的LXRs激动剂,可同时激活LXRα和LXRβ亚型,易透过血脑屏障发挥作用。LXRs的激动剂T0901317或者GW3965可减轻神经病理性痛的机械痛觉过敏,延迟肥胖引起的痛觉过敏。然而,LXRs在慢性痛中的作用在很大程度上仍是未知的。本研究拟建立完全弗氏佐剂（Complete Freund’s adjuvant,CFA）诱导的慢性炎性痛（Chronic inflammatory pain,CIP）小鼠模型,综合采用动物行为学、电生理学、分子生物学和表观遗传学等实验手段,开展以下研究:（1）明确LXRs功能失调是否参与CIP的发病;（2）探讨激活LXRs在CIP中发挥镇痛效应的可能机制;（3）确定GW3965发挥镇痛效应的LXRs受体途径;（4）阐明CIP中调控ACC区LXRβ表达和功能异常的表观遗传学机制。通过以上研究,旨在评价LXRβ作为治疗慢性痛药物新靶点的可能性,为慢性痛的临床研究和药物开发提供了新的研究思路以及理论依据。【研究方法】1.激活LXRs在改善CIP小鼠痛行为中的作用1.1检测LXRs在痛觉高度相关脑区——ACC区的表达情况免疫荧光染色检测LXRs,包括LXRα和LXRβ,在ACC区的表达及细胞特异性。将LXRβ分别与神经元标记物β-tubulin III、星形胶质细胞标记物GFAP、小胶质细胞标记物Iba-1进行共标,以确定LXRβ在ACC区的细胞表达模式;将LXRβ分别与兴奋性神经元标记物CAMK IIa、抑制性神经元标记物GAD67进行共标,以确定LXRβ在ACC表达的神经元类型。1.2 CIP小鼠ACC区LXRs表达的变化建立小鼠足底皮下注射CFA（CFA:0.9%生理盐水=1:1,共10μl）诱导的CIP小鼠模型。CFA注射后的1、3、5、7和14 d,Von Frey和热刺痛仪分别检测小鼠的机械痛和热痛行为。免疫组化染色和Western blot检测CIP模型小鼠不同时间点ACC区LXRα和LXRβ表达水平的变化。1.3 LXRs的激动剂GW3965对CIP小鼠痛行为的影响建立CIP小鼠模型,给予LXRs的激动剂GW3965预处理和后治疗,评价GW3965对CIP小鼠痛行为的影响。1.4 GW3965对CIP小鼠ACC区LXRs表达及功能的影响给予小鼠GW3965预处理后建立CIP小鼠模型,Western blot检测GW3965对LXRs表达的影响;酶联免疫吸附（ELISA）检测GW3965治疗前后CIP小鼠ACC和血清中LXRs的靶基因ATP结合盒转运子A1（ATP-binding cassette transporter 1,ABCA1）、载脂蛋白E（Apolipoprotein E,ApoE）的表达变化,以确定GW3965对LXRs功能的影响。1.5慢病毒下调ACC区LXRs的表达对小鼠痛行为的影响设计并包装LXRα、LXRβ的慢病毒干扰表达载体（short hairpin RNA for LXRα,shLXRα;short hairpin RNA for LXRβ,shLXRβ）,以及它们的阴性对照（short hairpin RNA for negative control,shNC）。利用脑立体定向和微量注射系统,分别向小鼠双侧ACC区定量注射慢病毒shLXRα、shLXRβ或shNC;2周后,Western blot检验shLXRα、shLXRβ下调ACC区LXRα、LXRβ蛋白表达的效果。Von Frey和热刺痛仪检测下调ACC区LXRα、LXRβ蛋白表达后,小鼠机械痛和热痛阈值的变化;同时,利用旷场实验和转棒实验,检测下调ACC区LXRα、LXRβ表达对小鼠自主运动能力的影响,以确保痛行为检测的准确性。1.6确定GW3965发挥镇痛效应的LXRs受体亚型途径采用慢病毒shLXRα、shLXRβ下调ACC区LXRα、LXRβ表达后,给予GW3965预处理,并建立CIP小鼠模型,观察shLXRα、shLXRβ对GW3965镇痛作用的影响,以确定GW3965发挥镇痛效应的LXRs受体亚型。2激活LXRs对CIP小鼠镇痛作用的机制研究2.1 CIP小鼠ACC区胶质细胞状态的变化Western blot方法检测CIP小鼠ACC区星形胶质细胞标志物GFAP、小胶质细胞标志物Iba-1表达水平的变化。2.2 GW3965对CIP小鼠ACC区丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPKs）信号通路的影响Western blot方法检测GW3965治疗前后,CIP小鼠ACC区MAPKs信号通路（ERK、JNK和p38磷酸化水平）的变化。2.3确定LXRs不同受体亚型在GW3965抑制MAPKs激活中的作用shLXRα和shLXRβ下调ACC区LXRα和LXRβ表达后,建立CIP小鼠模型,并给予LXRs的激动剂GW3965治疗,观察shLXRα、shLXRβ对CIP中GW3965介导的抑制MAPKs信号通路激活作用的影响,确定介导GW3965调控MAPKs信号通路的LXRs受体途径。2.4 GW3965对CIP小鼠ACC区核因子-κB（Nuclear factor-κB）信号通路的影响免疫共沉淀（Co-immunocoprecipitation,Co-IP）方法检测ACC区LXRβ与NF-κB p65之间是否存在相互作用。免疫荧光染色、Western blot方法检测给予GW3965治疗前后,CIP小鼠ACC区NF-κB p65和p50核转位活动的变化。2.5 GW3965对CIP小鼠ACC区促炎细胞因子释放的影响ELISA检测GW3965治疗前后CIP小鼠ACC和血清中TNF-a表达水平的变化。2.6 GW3965对CIP小鼠ACC区异常的突触传递的影响全细胞膜片钳检测CIP小鼠ACC区神经元兴奋性突触传递,包括由α-氨基-3羟基-5甲基-4异恶唑丙酸受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptor,AMPAR）介导的微小兴奋性突触后电流（miniature Excitatory postsynaptic currents,mEPSCs）发放的频率和幅度,以及不同输入电压下兴奋性突触后电流（Excitatory postsynaptic currents,EPSCs）,即Input-Output（I-O）曲线的变化。3组蛋白乙酰化修饰调控CIP中LXRβ表达的机制研究3.1 CIP小鼠ACC区组蛋白去乙酰化酶（HDACs）表达的变化Western blot检测CIP小鼠ACC区HDACs,包括HDAC2和HDAC5表达水平的变化,并观察其与ACC区LXRβ表达水平变化的关系。3.2 HDAC抑制剂（HDACI）SAHA对乙酰化组蛋白和LxrβmRNA水平的影响培养原代胎鼠皮层神经元,给予HDACI SAHA处理,Western blot检测乙酰化组蛋白H3（AcH3）和乙酰化组蛋白H4（AcH4）表达水平的变化,实时定量PCR（Real-time PCR,RT-PCR）检测LxrβmRNA水平的变化。3.3确定乙酰化组蛋白在Lxrβ启动子区域结合的位点针对Lxrβ转录起始位点上游2,000 bp的基因序列,设计、合成匹配度最佳的特异性引物。收集原代皮层神经元细胞,行染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）检测,结合PCR产物的启动子扩增测序,确定乙酰化组蛋白AcH3和AcH4在Lxrβ启动子区的结合位点。3.4 SAHA对Lxrβ启动子区乙酰化组蛋白水平的影响SAHA处理原代皮层神经元,采用ChIP结合RT-PCR,神经元AcH3和AcH4在Lxrβ启动子区的表达变化,以确定SAHA对Lxrβ转录的调控作用。【研究结果】1激活LXRs在改善CIP小鼠痛行为中的作用1.1 LXRs在ACC区的表达分布及细胞表达模式免疫荧光染色结果显示,LXRβ在ACC区广泛表达,而LXRα在ACC区的表达则很低。LXRβ主要表达在神经元,少量表达在星形胶质细胞和小胶质细胞。此外,LXRβ高表达于兴奋性神经元,少量表达在抑制性神经元上。1.2 CIP小鼠ACC区LXRs表达的变化Western blot和免疫组织化学染色结果显示,与Sham组相比,CIP小鼠ACC区LXRβ的表达显著降低,LXRα的表达很低且无显著变化。1.3 LXRs的激动剂GW3965对CIP小鼠痛行为的影响给予小鼠GW3965（0.1、1或10 mg/kg,i.p）的预处理或后治疗,可显著缓解CIP小鼠的痛觉超敏,且GW3965的镇痛作用呈剂量依赖性。1.4 GW3965对CIP小鼠ACC区LXRs表达及功能的影响Western blot结果显示,GW3965预处理不影响CIP小鼠ACC区LXRs的表达水平。ELISA结果显示,GW3965可显著提高CIP小鼠ACC和血清中ABCA1和ApoE的表达水平。1.5 shLXRs下调ACC区LXRs的表达对小鼠痛行为的影响Western blot结果显示,shLXRα、shLXRβ感染ACC区可显著下调LXRα、LXRβ的蛋白表达。Von Frey和热刺痛仪结果显示,与shNC组相比,下调ACC区LXRβ的表达,引起小鼠的热痛觉超敏,但不影响小鼠机械痛阈值。下调小鼠ACC区LXRα的表达,不影响小鼠的痛行为。旷场和转棒实验结果显示,shLXRs不影响小鼠的自主活动能力和焦虑行为。1.6确定GW3965发挥镇痛效应的LXRs受体途径Von Frey和热刺痛仪结果显示,shLXRβ可阻断GW3965对CIP小鼠的镇痛作用,而shLXRα不影响GW3965的镇痛效应,提示GW3965通过激活LXRβ受体亚型发挥镇痛作用。同时,shLXRβ增强CIP小鼠的热痛觉超敏,更加证明LXRβ在慢性痛发生发展中的重要作用。2激活LXRs对CIP小鼠镇痛作用的机制研究2.1小鼠ACC区胶质细胞状态的变化Western blot结果显示,CIP小鼠ACC区星形胶质细胞标志物GFAP的表达显著升高,小胶质细胞标志物Iba-1表达水平则无明显变化。2.2 GW3965对CIP小鼠ACC区激活的MAPKs信号通路的影响Western blot结果显示,与Sham组相比,CIP小鼠ACC区MAPKs信号通路相关蛋白p-ERK、p-JNK的表达水平显著提高,而p-p38的表达无明显变化;给予GW3965治疗可显著抑制ERK和JNK的磷酸化。2.3确定LXRs的不同受体亚型在GW3965抑制激活的MAPKs信号通路中的作用Western blot结果显示,下调小鼠ACC区中LXRβ的表达,可部分阻断GW3965介导的对p-ERK、p-JNK的抑制作用。下调ACC中LXRα的表达,无此抑制作用。2.4 GW3965对CIP小鼠ACC区NF-κB信号通路的影响Co-IP实验证明,ACC区LXRβ与NF-κB p65之间存在相互作用。Western blot结果显示,与Sham组相比,CIP小鼠ACC区NF-κB信号通路被激活。GW3965治疗可显著抑制IkBα的磷酸化、p65和p50的核转位。2.5 GW3965对CIP小鼠ACC区促炎细胞因子释放的影响ELISA结果显示,CIP小鼠ACC区促炎细胞因子TNF-α表达显著增加。GW3965可显著减少TNF-α的释放。2.6 GW3965对CIP小鼠ACC区异常的突触传递的影响全细胞膜片钳结果显示,与Sham组相比,CIP小鼠ACC区锥体神经元EPSCs的I-O曲线斜率、mEPSC发放频率显著增加。脑片灌流GW3965,可抑制神经元异常增强的I-O曲线斜率及mEPSC发放频率。3组蛋白乙酰化修饰调控CIP中LXRβ表达的机制研究3.1 CIP小鼠ACC区组蛋白去乙酰化酶（HDACs）表达的变化Western blot结果显示,与Sham组相比,CIP小鼠ACC区HDAC5表达水平显著增加,而HDAC2表达无明显变化。相关性分析显示,ACC区HDAC5的表达与LXRβ表达呈负相关。3.2 HDACI SAHA对乙酰化组蛋白和LxrβmRNA表达水平的影响Western blot结果显示,与Sham组相比,用SAHA处理原代皮层神经元,可显著增加AcH3和AcH4的表达水平。RT-PCR结果显示,SAHA可显著提高神经元LxrβmRNA的表达水平。3.3确定乙酰化组蛋白在Lxrβ启动子区域结合的位点RT-PCR产物的一代测序结果显示,AcH3和AcH4分别结合于Lxrβ转录起始位点上游大约1,900 bp（启动子I）、1,600 bp（启动子II）、和350 bp（启动子IV）区域,与Lxrβ转录起始位点上游大约1,100 bp（启动区III）的区域没有结合。3.4 HDACI SAHA对Lxrβ启动子区乙酰化组蛋白水平的影响ChIP结合RT-PCR结果显示,与Sham组相比,SAHA处理神经元1 h后,Lxrβ启动子I、启动子II和启动子IV区AcH3的表达即显著升高,24 h内逐渐降低恢复至基础水平。AcH4的表达无明显变化,提示,SAHA通过增加Lxrβ启动子区的AcH3水平,促进Lxrβ的转录活动。【研究结论】我们的研究揭示了LXRβ功能失调参与CIP神经炎症反应和中枢敏化;GW3965镇痛作用通过激活LXRβ实现;首次阐明了组蛋白乙酰化修饰调控LXRβ表达下降,参与CIP发病的表观遗传学机制。总结如下,（1）ACC区LXRβ的表达及功能异常参与慢性炎性痛的发生发展。（2）下调ACC区LXRβ的表达,引起小鼠的热痛觉超敏行为。（3）GW3965激活LXRβ,通过抑制ACC区神经炎症反应和异常的兴奋性突触传递发挥镇痛效应。（4）CIP小鼠ACC区HDAC5与LXRβ表达呈负相关。（5）HDAC5可能通过抑制Lxrβ启动子区AcH3水平,促进组蛋白去乙酰化,抑制Lxrβ转录,调控其表达。因此,我们的研究结果不仅阐明了LXRβ在慢性炎性痛中的作用和调控机制,也为慢性痛的治疗提供了新的策略和药物开发靶点。