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阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)，是一种发生于中老年的神经系统变性疾病，临床表现为记忆力减退、认知障碍、行为异常及精神症状。但AD确切的发病机制不清，是一种多因素共同作用而致的复杂异质性疾病。近期研究发现胰岛素信号转导异常与认知障碍相关，可能参与AD发病及进展，有学者提出AD是由于中枢神经系统脑胰岛素抵抗或减少而导致的“3型糖尿病”。AD患者脑内胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）丝氨酸位点(ser636/639/312)磷酸化水平升高致IRS-1活性受抑制，阻断其下游PI3K/Akt/mTOR的激活，从而导致胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)的发生。研究表明，细胞内mTOR信号通路异常会导致自噬功能障碍。AD由于细胞内自噬体的成熟、转运及自噬溶酶体形成障碍，导致自噬体大量堆积，从而引起Aβ清除受阻而致斑块沉积，其被认为是AD脑内特征性改变。随着AD脑内IR机制的揭示，如何减轻脑IR进而改善自噬功能障碍，减少Aβ沉积成为AD治疗的热点，但是到目前为止相关药物的开发仍有限。 Humanin是从AD患者大脑枕叶通过cDNA文库的办法合成的线性肽，S14G-humanin(HNG)是其衍生物。目前研究表明HNG可通过抑制Aβ形成及沉积、改善突触功能、抑制基因突变所致神经毒性、减少炎症因子等起到神经保护作用。但HNG能否通过减轻脑IR，调节胰岛素信号转导，从而改善脑神经元自噬功能障碍，进而减少Aβ沉积发挥其神经保护作用尚无报道。 目的:本实验以APP/PS1转基因小鼠为对象，研究了HNG对此动物模型脑内胰岛素信号转导及其下游自噬功能的影响。通过应用Western blot、免疫组化及Real-time PCR等方法，初步探讨了HNG通过调节胰岛素IRS-1/PI3K/Akt/mTOR信号转导，改善脑神经元自噬功能障碍及减少Aβ沉积的机制。 方法:选取9月龄APP/PS1转基因小鼠24只，雌雄各半，随机分为3组，即模型组(Tg)、HNG低剂量组(Tg/HNG-L)、HNG高剂量组(Tg/HNG-H)，同时选取同月龄C57BL/6J小鼠8只为对照组(NT)。给药方法如下:NT组:每天给予0.5ml生理盐水腹腔注射1次，连续4周;Tg组:每天给予0.5ml生理盐水腹腔注射1次，连续4周;Tg/HNG-L组:每天给予0.5ml生理盐水稀释HNG(50μg/kg)腹腔注射1次，连续4周;Tg/HNG-H组:每天给予0.5ml生理盐水稀释HNG（100μg/kg）腹腔注射1次，连续4周。给药第3周末应用Morris水迷宫实验检测小鼠的空间学习及记忆能力。给药第4周末，各组小鼠处死取材，一半大脑放入4％多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，应用免疫组织化学方法检测IRS-1pSer636、mTOR及Aβ斑块等指标的表达，另一半脑组织剥离出的海马储存于-70℃液氮罐，应用Western blot法检测IRS-1、IRS-1pSer636、PI3K、Akt、p-AktSer473、S6K1、ULK1、P62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ等蛋白表达水平，Real-time PCR检测ULK1、P62、LC3的mRNA表达水平。 结果:1、Morris水迷宫定位航行和空间探索实验显示，Tg组小鼠较NT组小鼠逃避潜伏期、寻找平台平均路程均延长或增加及穿梭原平台所在象限的次数减少(P＜0.05)，表明APP/PS1小鼠具有明显的学习记忆障碍;Tg/HNG-L组与Tg/HNG-H组小鼠较Tg组逃避潜伏期、寻找平台平均路程均缩短或减少（P＜0.05）及穿梭原平台所在象限的次数及穿梭原平台所在象限的次数增加(P＜0.05），提示HNG可以改善APP/PS1转基因小鼠的学习与记忆能力。2、Western blot及免疫组化结果显示，Tg组小鼠海马IRS-1pSer636蛋白表达水平较NT组显著升高(P＜0.05)，提示9月龄APP/PS1转基因小鼠存在脑胰岛素抵抗;Tg/HNG-L组和Tg/HNG-H组小鼠海马IRS-1pSer636蛋白表达水平较Tg组明显降低（P＜0.05），提示HNG治疗可通过降低IRS-1在丝氨酸636位点的磷酸化水平从而促使APP/PS1小鼠脑IRS-1信号下传，改善脑胰岛素抵抗状态。3、Western blot结果显示，Tg组小鼠海马PI3K及p-AktSer473蛋白表达水平较NT组明显减少（P＜0.05），提示9月龄APP/PS1转基因小鼠脑内PI3K匮乏及胰岛素信号下传受阻;与Tg组相比，Tg/HNG-L组和Tg/HNG-H组小鼠海马PI3K及p-AktSer473蛋白表达水平明显增加(P＜0.05)，提示HNG可以通过改善APP/PS1小鼠海马内的PI3K匮乏状态及上调pAkt Ser473蛋白表达水平，从而减轻脑胰岛素抵抗。4、免疫组化及Western blot结果显示，Tg组小鼠海马mTOR及S6K1蛋白表达增加(P＜0.05)，提示9月龄APP/PS1转基因小鼠脑内胰岛素通路转导受阻;给予HNG治疗4周后，Tg/HNG-L组和Tg/HNG-H组小鼠海马mTOR及S6K1蛋白表达降低(P＜0.05)，提示此模型经HNG治疗后mTOR/S6K1活性减低，纠正胰岛素通路紊乱，胰岛素抵抗减轻。5、Western blot及Real-time PCR结果显示，Tg组小鼠海马ULK1蛋白及mRNA表达水平较NT组明显减少（P＜0.05），提示9月龄APP/PS1转基因小鼠脑内存在ULK1信号转导障碍;Tg/HNG-L组和Tg/HNG-H组小鼠经HNG治疗后海马ULK1蛋白及mRNA表达水平较Tg组明显增加（P＜0.05），提示HNG可以增加APP/PS1小鼠海马内的ULK1蛋白表达，提高此动物模型脑内清除异常蛋白的自噬水平，减轻自噬功能障碍，并呈剂量相关性。6、Western blot及Real-time PCR结果显示，Tg组小鼠海马P62蛋白、mRNA表达水平较NT组明显增加(P＜0.05)，提示9月龄APP/PS1转基因小鼠脑内存在自噬功能障碍，自噬活性明显下降。经HNG治疗后的Tg/HNG-L组和Tg/HNG-H组小鼠海马P62蛋白、mRNA表达较Tg组减少（P＜0.05），说明HNG可以在转录和蛋白表达水平诱导自噬过程中P62与底物的共同降解，引起P62水平下降，以便堆积的自噬体能与溶酶体形成自噬溶酶体，从而清除异常蛋白。7、Western blot及Real-Time PCR结果显示，Tg组小鼠海马LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达及LC3mRNA水平较NT组明显增加（P＜0.05），说明9月龄APP/PS1转基因小鼠脑内有大量自噬体堆积。与Tg组相比，Tg/HNG-L组和Tg/HNG-H组小鼠海马LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达减少(P＜0.05)，但LC3mRNA表达水平无显著性差异（P＞0.05），提示HNG不是通过上调LC3基因转录水平，而是通过降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，从而减少自噬体堆积，促进了自噬溶酶体的形成。8、免疫组织化学方法显示，与NT组比较，Tg组小鼠海马Aβ斑块数量明显增多、面积增大（P＜0.05），说明9月龄APP/PS1转基因小鼠脑内有异常Aβ沉积。治疗后Tg/HNG-L组和Tg/HNG-H组小鼠海马Aβ斑块数量减少、面积缩小，提示HNG能有效减轻APP/PS1小鼠海马Aβ沉积。 结论:1、HNG可以明显改善APP/PS1转基因小鼠的空间学习记忆能力。2、APP/PS1转基因小鼠海马IRS-1pSer636蛋白表达增加，而PI3K/p-AktSer473蛋白表达减少，mTOR/S6K1表达增加，提示APP/PS1转基因小鼠海马胰岛素信号转导异常，存在脑胰岛素抵抗。3、HNG通过下调IRS-1pSer636蛋白表达，进而上调PI3K/p-AktSer473活性及下调mTOR/S6K1活性，促进胰岛素信号下传，减轻APP/PS1转基因小鼠脑胰岛素抵抗。4、APP/PS1转基因小鼠海马神经元存在自噬启动受阻、自噬活性下降及自噬体堆积等自噬功能障碍。5、HNG可促进APP/PS1转基因小鼠海马神经元内的自噬启动、提高自噬活性及减少自噬体堆积，从而减轻自噬功能障碍，进而减少脑内淀粉样斑块沉积。6、HNG可能是通过调节IRS-1/PI3K/Akt/mTOR通路活性，继而改善APP/PS1转基因小鼠海马自噬功能障碍。