论文部分内容阅读
螺旋粉虱Aleurodicus dispersus Russell是一种重要的入侵害虫，现已入侵到美洲、太平洋和大西洋部分岛屿、亚洲东南部、非洲、大洋洲的多个地区和国家；我国的台湾和海南地区也先后被该虫入侵。螺旋粉虱危害蔬菜、果树等热带经济作物，同时还可传播植物病害危害。在台湾和海南地区，均可常年发生危害。昆虫体内是一个复杂、庞大的微生态系统，微生物可与昆虫形成稳定的共栖(commensalisticsymbiosis)、互惠共生(mutualistic symbiosis)等关系。本研究以16S rRNA基因为基础，利用限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)建立16S rRNA文库和变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)指纹图谱分析了螺旋粉虱体内微生物的多样性。利用基因片段快速检测法，检测了螺旋粉虱体内可能与性比相关的部分微生物。利用超薄切片透射电镜(transmission electron microscope，TEM)和荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization，FISH)，研究了螺旋粉虱体内微生物形态结构、分布位置等基本信息。主要结果如下： 1以16S rRNA为基础，通过PCR-RFLP建立了番石榴Psidium guajava L.、木薯Manihot esculenta Crantz(M.utilissima Pohl)、印度紫檀Pterocarpus indicus、辣椒Capsicum frutescens L.、一品红Euphorbia pulcherrima Willd上螺旋粉虱雌、雄成虫体内微生物的10个16S rRNA文库，分析了螺旋粉虱体内微生物多样性。每个文库挑取192个以上阳性克隆子，以27f和1492r为引物扩增后，再经afaⅠ和mspⅠ双酶酶切，获得40个不同的片段长度多态性指纹图谱(称操作单元，operational taxonomic unit，OTU)。根据指纹图谱结果分析，每个文库所分布操作单元(OTU)结果均不相同，表明不同寄主上螺旋粉虱成虫体内微生物的群落结构略有差别，且雌、雄成虫间也略有差别。经RDP classifier分类及比对GenBank后构建的NJ系统发育进化树分析，可将40个操作单元分成不同的系统发育型细菌(plylotype)，能归属到变形菌门(proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)，表明螺旋粉虱体内微生物多样性丰富。能鉴定出Arsenophonus sp.，Candidatus porteia aleyrodidarum等螺旋粉虱体内内共生菌，且稳定的存在于所有螺旋粉虱样品体内。 2通过PCR-DGGE方法分析了不同寄主上的螺旋粉虱体内细菌的多样性。以16SrRNA V3区为目的片段，进行PCR扩增，DGGE电泳后，回收电泳条带16个。与GenBank数据库比对和系统发育进化分析，可鉴定出6个系统发育型细菌(plylotype)包括：Arsenophonus sp.，Candidams porteia aleyrodidarum，Pseudomonas sp.，Pantoeasp.，Rhizobium sp.，Aeromonas sp.，另外还有一些序列与Genbank中未培养环境样品有较高同源性，而未能确定。Arsenophonus sp.和Candidatus porteia aleyrodidarum仍为螺旋粉虱体内优势菌群。同16S rRNA文库结果一样，不同样品所得电泳条带分布有一定的差异，表明不同寄主上螺旋粉虱体内的微生物群落结构可能存在差异。 3通过对番石榴和印度紫檀上螺旋粉虱种群动态调查，发现其性比存在偏差，均在0.55-0.75之间变化。共检测了Hamiltonella defense，沃尔巴克纳氏体Wolbachina，杀雄菌Arsenophonus，Fritschea bemisiae，Cardinium hertigii，立克次氏体Rickettsia，螺旋体Spirochetes7种可能影响昆虫性比的微生物。结果表明螺旋粉虱体内仅存在杀雄菌属(Arsenophonus)，且在不同寄主上螺旋粉虱体内稳定存在，与16S rRNA文库和PCR-DGGE分析结果一致。 4通过解剖观察了螺旋粉虱消化道结构，可见肾形唾液腺、环状中肠、指状盲肠、滤室以及连接室等结构。通过透射电镜(TEM)可在螺旋粉虱体内能观察到聚集的和游离的大量微生物。聚集的微生物出现在中肠附近，栖息于一个类似“囊形胃”的体腔中，形态分为不规则杆状、球孢形；但没有观察到蚜虫体内“Buchnera”式的含菌胞(mycetocytes)或类菌胞(bacteriocytes)。游离的微生物则常见游离于体腔内，大多具有典型的“三层膜”结构，可在脂肪体、储精囊(seminal vesicle)等组织观察到。 5通过荧光原位杂交(FISH)定位观了Pantoea sp.(MAB4)和Arsenophonus sp。(MABE3)在螺旋粉虱体内的分布，其中Pantoea sp.主要分布在肠道周边；而Arsenophonus sp.则主要分布卵块周边，且有菌株已进入到卵粒中。较强的绿色荧光区域均只在螺旋粉虱雌虫中被观察到，而雄虫和阴性对照均没观察到。Pantoea sp。和Arsenophonus sp.不同的分布位置，可能与其功能不同有关。