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肌醇磷脂依赖的磷脂酶C(PI-PLC)是肌醇磷脂信号系统中的一个关键酶,该信号系统在动植物细胞的生长发育及介导胞外信号的跨膜传递中发挥着重要的作用,其作用的分子机制已经成为目前研究的热点。测序工作完成之后,发现拟南芥基因组中有9种不同的PLC基因,其可能参与了不同的植物生理过程。探讨哪一种或几种PLC亚型基因参与花粉发育及萌发过程,不仅可以为PLC的功能研究和作用机制的探讨提供重要的依据,还可以为花药发育过程的研究提供依据。
本研究以拟南芥AtPLC2的突变体为材料,利用反向遗传学的方法,通过遗传转化、RT-PCR等分子生物学及组织化学分析及切片花粉观察发育过程,进行PLC参与花药发育及花粉萌发过程功能的研究。
主要结果如下:
1.对来自ABRC的拟南芥的T-DNA插入AtPLC2基因突变体进行筛选和鉴定。通过Kanr平板筛选与PCR检测仅获得突变杂合体PLC2/plc2-2,RT-PCR检测该杂合体中AtPLC2基因表达降低。另外,我们构建了AtPLC2的RNAi载体用于遗传转化工作,获得了AtPLC2基因的沉默植株,命名为atplc2i。
2.通过对杂合体PLC2/plc2-2的表型检测和遗传分析,发现AtPLC2基因对花粉的发育是必须的。主要证据有:①T-DNA插入AtPLC2基因的突变体纯和致死。②杂合体PLC2/plc2-2的花粉不能将含有T-DNA的花粉遗传给后代。③石蜡切片与树脂半薄切片检测,发现PLC2/plc2植株花粉在第一次有丝分裂后液泡重组时产生缺陷,花粉囊中带有T-DNA插入的成熟花粉败育。这些结果表明AtPLC2基因可能是通过调节囊泡重组参与了花粉发育的生理过程。
3.通过对杂合体PLC2/plc2-2和atplc2i等AtPLC2基因表达下调的植株表型分析,发现AtPLC2基因的表达缺陷导致长角果发育缺陷,长角果内种子数减少,长角果总数增加。RT-PCR分析结果暗示该表型可能是由于AtPLC2基因的表达缺失影响了生长素相关基因造成生长素分布失调造成的。通过对花粉的生化染色分析,AtPLC2功能缺失造成花粉发育中断。