论文部分内容阅读
纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种由纳豆菌(Bacillus natto)产生的丝氨酸蛋白酶。高活力的纳豆激酶产品开发成为具有溶栓功效的功能性食品领域的研究热点。选择特色的发酵底物,并对发酵培养基及发酵条件进行优化,是降低纳豆激酶生产成本的重要途径。本文以荞麦为底物通过液态发酵同时获得高活性纳豆激酶、富含多酚的发酵产物,为利用纳豆菌开发具有显著溶栓、抗氧化活性的功能性食品提供理论和方法的指导。研究结果如下:(1)通过单因素法优化基础培养基,蛋白酶活从423.38 U/mL提升至1340 U/mL,纳豆激酶酶活从340.45 U/mL提升至630U/m L。在基础培养基中添加糙米和荞麦可显著促进纳豆菌产纳豆激酶、蛋白酶。采用浸泡蒸煮处理四种谷物、延长发酵时间可显著提高其发酵产物的蛋白酶酶活、纳豆激酶酶活。添加谷物(尤其是荞麦)发酵,可显著提高纳豆菌液态发酵产物抗氧化活性。谷物多酚、肽类物质与微生物代谢产物是发酵产物发挥抗氧化活性重要的物质基础。(2)以荞麦为原料,通过常温浸泡、加水打浆、联合耐高温α-淀粉酶的前处理方法,获得以荞麦为底物的发酵培养基。采用酶法制备大豆蛋白酶解产物,作为补充氮源添加至发酵培养基,并对比其与商业大豆蛋白胨作为补充氮源时菌体生长规律以及代谢物质(酶、可溶性蛋白、还原糖、多酚及抗氧化物质)变化规律,通过优化纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶揺瓶、2.5 L发酵罐条件,可制备具有高纳豆激酶活性(152.5 FU/mL,与商业大豆蛋白胨组相比,酶活提升了38%)、富含谷物多酚(0.109 mg/mL)且具有强抗氧化活性的发酵产物(27.43μmol Trolox equiv/mL)。本研究所制备的加脱脂乳粉的纳豆冻干粉的酶活及稳定性显著高于国产纳豆冻干粉,可以与著名进口商品媲美。(3)从发酵产物中共分离鉴定出8种多酚类化合物:咖啡酸、原儿茶酸、丁香酸、绿原酸、儿茶素、芦丁、牡荆素、金丝桃苷。采用超滤、乙醇分级沉淀及XAD-16大孔树脂对发酵产物进行分离纯化,获得富含抗氧化肽的洗脱组分(蛋白含量:66.51%;ORAC:1731.52μmol Trolox equiv/g)。从洗脱组分中共分离鉴定出28条多肽,在BIOPEP数据库当中搜索均未经报道,且所有肽段都包含疏水性氨基酸,其中有13条肽段含有至少一个强抗氧化氨基酸。GDKIYNVF中的IY片段、CRNLLLYPAGA中的LY片段、PWFFTST中的PW片段以及QGSGGPPIV中的GPP片段等在BIOPEP数据库中均被报道具有抗氧化活性。所鉴定的多酚、多肽是发酵产物发挥抗氧化活性重要的物质基础。