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过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)是一类由配体激活的转录因子,属于核受体超家族的成员。PPARs存在三种亚型:PPARα、PPARβ/δ和PPARγ。其中PPARγ可由多种脂肪酸及其代谢产物激活,在机体糖类和脂类代谢中起到重要调节作用,与2型糖尿病、动脉粥样硬化、高血压等多种代谢性疾病以及炎症、肿瘤等的发生密切相关。目前,PPARγ作为多种疾病治疗的一个重要靶分子,正受到越来越多的关注。近年来发展较快的噬菌体肽库筛选技术正广泛应用于小分子药物设计、重组疫苗研制、抗病毒药物筛选及细胞信号传导研究等领域,其筛选的共同点是钓取与蛋白(如抗体,受体,酶)特异性结合的配基。这种筛选功能性短肽的策略对于PPARγ与其作用分子的研究有很大的借鉴意义。本研究表达纯化了PPARγ配体结合域(ligand bind- ing domain, LBD)的his融合蛋白,并以之为靶,从噬菌体肽库中筛选结合PPARγ受体的短肽,对短肽分子进行了初步鉴定,为进一步研究PPARγ作用的分子机理以及开发以PPARγ为作用靶点的药物奠定了基础。本研究进行了以下工作:1.在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达核受体PPARγ配体结合域的融合蛋白。经终浓度为0.5mmol/L的IPTG在20℃诱导表达12小时,重组PPARγ-LBD融合蛋白得到高效表达。SDS-PAGE分析可见,表达蛋白的分子量约为34kD,近半数以可溶蛋白形式存在。2.利用Ni2+-NTA纯化系统对表达蛋白进行有效纯化。纯化蛋白在SDS-PAGE上呈现单一条带,凝胶成像系统软件分析纯化蛋白的纯度大于90%。3.以纯化的重组PPARγ-LBD融合蛋白为靶,采用固体包被法对噬菌体展示随机十二肽库及环七肽库进行亲和筛选。ELISA法鉴定特异结合的高亲和力阳性噬菌体单克隆并测序,获得与PPARγ-LBD高亲和力的噬菌体展示十二肽单克隆3个,环七肽单克隆5个,十二肽中出现LXXLL基序,环七肽序列中包含较为特征性的DXXRW序列。再经ELISA法从测序后的阳性噬菌体展示肽中选择与PPARγ-LBD亲和力最高的肽段,进行多肽合成。 <WP=9>4.利用PPARγ的高亲和力配体Rosiglitazone与噬菌体小肽进行竞争性结合抑制实验,Rosiglitazone不影响噬菌体小肽与靶蛋白的结合。筛选所得小肽与Rosiglitazone类配体的结合位点不同。本实验在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并利用Ni2+-NTA系统分离纯化,得到了纯度较高的重组人PPARγ-LBD融合蛋白。利用噬菌体肽库筛选技术从噬菌体展示十二肽及环七肽库中获得了具有PPARγ结合活性的十二肽及环七肽序列,它们与配体Rosiglitazone的结合位点不同。本实验为深入研究PPARγ作用的分子机理及开发以PPARγ为作用靶点的药物奠定了基础。