【摘 要】
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蛇毒中分泌型磷脂酶A2被广泛用来作为药理学工具,以研究它们在各种不同的病理生理过程中的作用。其中,部分分泌型磷脂酶A2被发现具有阻断电压门控型钾离子通道(K channels)的作
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蛇毒中分泌型磷脂酶A2被广泛用来作为药理学工具,以研究它们在各种不同的病理生理过程中的作用。其中,部分分泌型磷脂酶A2被发现具有阻断电压门控型钾离子通道(K<,v> channels)的作用。然而,大多数关于其对离子通道作用的研究是通过作用于运动神经末梢间接完成的,极少研究结果是直接作用于神经元细胞的。这里本文报道了一种新的蛇毒分泌型磷脂酶A2神经毒素:natratoxin,它来源于中华眼镜蛇,在天然状态下以单体形式存在。经SDS电泳,该蛋白的分子量为14 kDa左右。根据测定的N端序列和其它蛇毒的同源蛋白的高度保守序列设计了引物,首次从蛇腺中克隆natratoxin全长cDNA,其中360bp为蛋白编码框,编码119个氨基酸残基。全长序列比对显示它和其他种属的蛇毒PLA2蛋白有很高的同源性。通过对背根神经节的神经元全细胞膜片钳确定了其功能特征,发现natratoxin有效地抑制了A型钾电流并改变了通道的门控特性。因此,natratoxin是作为一个K<,v>通道的门控调节剂起作用的。而且实验证明这一抑制效应与其酶活性无关。这些结果表明,该毒素通过与Kv通道结合来执行其抑制效应。
为了进一步阐明这一电生理现象的结构基础,对natratoxin的三维结构进行了研究。在高盐溶液中获得了单晶,并且收集到2.2A分辨率的晶体衍射数据,晶体的空间群为P4<,1>。利用分子置换的方法获得了相位,修正了natratoxin的晶体结构。结构分析表明natratoxin单体的结构主要由三个α螺旋和一对反平行β折叠构成,并由14个在一级序列中严格保守的半胱氨酸残基构成的7对二硫键稳定其结构。在整体结构上,natratoxin作为sPLA2家族的一员是非常保守的,局部上的差异主要位于钙结合区域和C末端。然而作为一个K<,v>通道的抑制剂,natratoxin与其它毒素类抑制剂在整体结构上有着巨大的差异。在与其它K<,v>通道抑制剂的比较中我们发现在natratoxin的C端有一个功能区域与其它抑制剂有很高的一致性,而这个功能区域在抑制剂与K<,v>通道相互结合中起着重要作用。研究结果表明了这个功能区域是怎样通过关键性残基的作用来达到识别并结合K<,v>通道的目的,这对进一步研究K<,v>通道的结构与机制提供了帮助。
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