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本文采用花曲柳(Fraxinus rhynchophylla)休眠芽萌发展开的小叶作为研究对象,研究了其愈伤组织的诱导、继代培养、悬浮培养体系的建立;为了从花曲柳悬浮培养体系中获得更加丰富的秦皮甲素、秦皮乙素,我们对其次生代谢调控进行了初步研究,采用外源MeJA诱导的方法考查其对悬浮培养物各项生理指标及次生代谢产物积累量的影响。以小叶作为外植体诱导花曲柳愈伤组织未见报道,并且首次建立了花曲柳悬浮培养体系。以上研究对花曲柳组织培养技术有积极的推动作用,也为花曲柳悬浮培养体系建立生物反应器,进行香豆素类物质的工厂化生产奠定了基础。从外植体的消毒方式的研究中,我们发现采用75%乙醇预消毒25-30s,再用10%Ca(C10)2消毒1Omin所得到的的外植体除菌率高,褐化程度低。在WPM+1.5mg/L NAA+0.1mg/L TDZ的培养基中,愈伤组织的诱导率可达60%,愈伤组织的体积较大,颜色翠绿,生长旺盛。低浓度的生长调节剂组合较易诱导出疏松,淡黄的愈伤组织,高浓度的生长调节剂诱导出的花曲柳愈伤组织较为质密,颜色也较深,但褐化程度往往也较高。在愈伤组织继代培养的研究中,采用NAA和TDZ的生长调节剂组合,考查花曲柳愈伤组织在不同激素浓度下的继代增殖倍数。分别得到了回归方程yNAA=-1.0762x2+4.0333x+1.6716(R2=0.9789)和 yTDZ=-210.92x2+53.367x+2.0448(R2=0.9837)。两个方程的拟合效果较好,分别对其一阶导数求极值得到了花曲柳继代培养的最佳培养基WPM+1.87mg/L NAA+0.13mg/L TDZ,花曲柳在此培养基下培养30 d增殖倍数为5.45。悬浮培养基中愈伤组织的生长量和很多因素有关,我们得到了本研究中花曲柳悬浮培养的最优条件,即培养基组合1/2 WPM+1.2 mg/L NAA+0.07 mg/L TDZ,接种量为3 g/50 mL,摇床转速为100 rpm的培养条件最利于花曲柳悬浮愈伤组织生长。我们发现花曲柳悬浮愈伤组织基本呈现出S型生长,1～3d为延滞期,4～7d为对数生长期,8～11d为稳定期,12d之后进入衰亡期。秦皮甲素、秦皮乙素在花曲柳悬浮愈伤组织培养周期中变化趋势一致,延迟期和对数期含量较低,稳定期后秦皮甲素、秦皮乙素含量开始增加,在整个培养周期中,秦皮甲素、秦皮乙素产量最高点分别为最低点含量的1.5和1.8倍,秦皮甲素达到0.769mg/g(干重),秦皮乙素达到0.0099 mg/g(干重)。CAT和SOD作为植物细胞的两种防御酶,在延滞期和对数期这两种酶的活力相对较低,稳定期以后细胞活力降低,细胞间的竞争作用加剧,CAT和SOD这两种防御酶含量开始增加,随着细胞的大量死亡其含量又有所降低。PAL为细胞抗逆过程的防御酶,也是香豆素生物合成途径上游的关键酶,因此其变化规律与秦皮甲素、秦皮乙素积累量关系也比较密切,花曲柳悬浮愈伤组织中PAL的变化趋势为降低-增高-降低趋势,即延迟期对数期PAL活力较低,稳定期增高,衰亡期降低的特点。在添加了不同浓度(50 μM、100 μM和200 μM)的MeJA后,花曲柳悬浮愈伤组织鲜重变化受抑制程度不明显,仅在48h有明显抑制。总的来说各浓度处理的细胞活力均体现出波动降低的趋势,表明外源MeJA对花曲柳悬浮愈伤组织的细胞活力有抑制作用。我们发现添加MeJA能够对花曲柳悬浮愈伤组织中秦皮甲素、秦皮乙素积累量产生较明显的促进作用。以添加100 MeJA对花曲柳悬浮愈伤组织的诱导效果最为显著。24 h时秦皮甲素的积累量较对照组增加了 68.67%,秦皮乙素的积累量增加了36.36%。在外源MeJA处理后三种防御酶活力较对照组相比均有所增加。表明MeJA对花曲柳愈伤组织细胞的胁迫刺激细胞产生应激反应。三种防御酶活力在MeJA处理后达到最大的时间均较对照组有所提前,各浓度在24h内均达到最大,随MeJA诱导作用的消除而逐渐减小。