论文部分内容阅读
本文研究了以包含体形式表达的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)在常用的脲-精氨酸辅助复性溶液体系中的复性过程,在稀释复性的基础上,着重考察了离子交换色谱复性,并以反相色谱为主要分析手段探讨了rhG-CSF在两种复性方式中折叠的不同特点,探讨了rhG-CSF在不同复性方式下复性效果不同的原因,分析了影响离子交换色谱复性效果的主要因素并提出了改进的思路.首先考察并比较了rhG-CSF在无添加剂的缓冲液、加有L-精氨酸的缓冲液、以及脲-精氨酸混合溶液中的稀释复性的特点.然后研究了以DEAE Sepharose Fast Flow为代表的阴离子交换柱上复性rhG-CSF.除了使用常规的NaCI溶液作为洗脱剂外,尝试了将精氨酸直接用作离子交换色谱复性的洗脱剂,显著地提高了色谱复性效率.通过比较三缓冲液系统(流动相按高浓度变性剂-低盐复性缓冲液-高盐复性缓冲液的顺序转换)和双缓冲液系统(流动相按高浓度变性剂-高盐复性缓冲液的顺序转换)的两种洗脱方式对于复性效果的影响,提出:1)在被吸附于离子交换介质上的状态下,rhG-CSF难以折叠复性,复性在洗脱过程中,蛋白具有一定的空间自由度时才能发生,因此,通过降低蛋白质分子数和色谱吸附位点数的比值来减小洗脱时蛋白在柱中的拥挤程度可能是提高复性效率的一个重要途径;2)洗脱时流动相中足够低的脲浓度对于rhG-CSF复性是重要的,双缓冲液系统洗脱方式复性的rhG-CSF的活性之所以比稀释复性和三缓冲液系统洗脱方式复性的rhG-CSF都明显偏低,和沈脱时流动相脲浓度太高有关.此外,还尝试了在CM Sepharose Fast Flow阳离子交换柱上复性rhG-CSF,将合适的pH梯度与脲梯度联合使用可以明显提高复性效果,但阳离子交换复性的pH难以控制,容易生成无活性的中间体,总蛋白收率也比较低.用反相色谱作为主要分析手段对rhG-CSF在精氨酸溶液中,脲-精氨酸混合溶液中的稀释复性、阴离子交换色谱柱上的穿过复性以及阴、阳离子交换色谱复性进行了监测,比较了它们各自的特点,并由此对各种复性方法的复性效果差异进行了解释,发现并着重分析了阴离子交换色谱复性的rhG-CSF独特的折叠状态.