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研究背景:胃癌（Gastric carcinoma）是胃黏膜上皮来源的恶性肿瘤,2018年中国癌症报告显示胃癌发生率居第二位,死亡率位居第三位,其好发于中老年人群,男性中高发,男性发病率是女性的两倍。胃癌可发生于胃的任何部位,胃窦部癌占一半以上。胃癌病因有多种因素,第一:胃癌发病率在不同区域发病率不同,国内东西部及北方地区胃癌发病率高于南部地区。流行病学调查发现东西部及北方地区的人群,有熏烤和腌制食品的习惯,经过腌制或者熏烤的食物中亚硝酸盐、多环芳烃化合物等毒性物质含量增高;第二:幽门螺杆菌（Hp）感染,幽门螺杆菌可导致硝酸盐转化成亚硝酸盐和亚硝胺并导致胃癌;Hp感染定植于胃黏膜上皮后,可以产生Cag A、Vac A有毒产物,尤其Cag A具有一定的促癌作用;第三:一些胃的癌前病变,良性疾病行胃部分切除后的残胃,腺瘤性息肉、萎缩性胃炎,而这些病变因为手术改变导致反流刺激和Hp感染促使胃黏膜上皮变成肠上皮化生或非典型增生,最终转变为癌,而增生性息肉属于非肿瘤性息,一般不会发生癌变。第四:遗传因素,在临床工作我们发现部分胃癌患者具有家族性,一方面可能是共同的饮食习惯,另一方面具有相同遗传背景,说明基因可能参与其中。有研究发现,胃癌的近亲罹患胃癌几率大大增加。胃癌的发生是多个因素,逐步发展起来的,而在这个过程的不同阶段可能涉及到多种调控基因的变化,如抑癌基因失活,癌基因的活化,凋亡基因沉默等,形式也是多种多样的。而胃癌发生、发展的调控机制尚不清楚。为了获得胃癌新的诊断和治疗方法,从而提高胃癌患者生存期,需要对胃癌的发生机制作进一步探讨。微小RNA为小的单链RNA,长度为18-25个核苷酸,广泛分布于原核和真核细胞中。它是由其编码的基因DNA转录而成,不具有开放阅读框,所以不能翻译成蛋白质,其主要功能是调节其他基因的蛋白质合成。mi RNA与靶基因m RNA的序列结合,主要为3’非编码区（untranslated region,UTR）,可以与靶基因m RNA互补结合后被RISC降解或阻止靶基因m RNA被核糖体结合从而阻止蛋白质翻译。不同基因编码的m RNA可能具有一段相同的碱基序列,从而能被同一mi RNA识别,而一个m RNA上可能含有多个mi RNA识别结合位点,从而协调或者拮抗调控同一基因。迄今为止,人类基因组中共发现约1800多个mi RNA前体,成熟体达2500多个。mi RNA在胃癌中作用的研究有很多报道,根据mi RNA作用下游靶基因功能的不同,mi RNA扮演不同角色,若下游靶基因为癌基因,则mi RNA充当抑癌基因角色,若下游靶基因为抑癌基因,则mi RNA充当癌基因的角色。mi R-100是本课题组一直长期研究的一个mi RNA。文献报道mi R-100在肝癌、小细胞肺癌、急性髓细胞白血病中高表达,而在乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌等低表达,而在胃癌中文献报道不尽相同,有文献报道在组织中高表达,也有文献报道低表达,而mi R-100剪切成成熟体时可以生成mi R-100-5p和mi R-100-3p,两者核苷酸序列完全不同,所识别的靶基因也不同,而上述文献研究重点为mi R-100-5p在胃癌中作用,而本次研究关注点为mi R-100-3p在胃癌中功能。我们在前期的研究中发现mi R-100-3p在胃癌组织及胃癌细胞中呈现低表达,其生物学功能在胃癌中未见深入研究。BMPR2称为骨形态发生蛋白受体II型,为丝氨酸/苏氨酸受体激酶。它结合骨形态发生蛋白（BMP）,属于TGFβ超家族的成员,其参与旁分泌信号传导。BMPs参与许多细胞功能,包括成骨,细胞生长和细胞分化。在多种恶性肿瘤扮演癌基因的角色,如能促进软骨肉瘤细胞增殖并且抑制细胞凋亡、自噬;通过生物信息学数据库数据分析,BMPR2表达水平与胃癌生存期有密切的联系。那么在胃癌的发生、发展中,mi R-100-3p是否起到抑制胃癌的作用?mi R-100-3p是否通过或者部分通过BMPR2起到调节作用?将是我的研究重点。本课题将结合mi R-100-3p在胃癌细胞株和胃癌组织中以及BMPR2在胃癌组织中的表达情况,分析mi R-100-3p及BMPR2与胃癌患者临床病理因素的相关性,通过人为改变（敲低或者过表达）mi R-100-3p表达水平,观察胃癌细胞在增殖、细胞周期、侵袭转移、凋亡能力的变化;通过转录组学分析上调mi R-100-3p前后转录水平变化从而发现可能的下游靶基因,再结合生物学软件预测,锁定可能的下游靶基因,最后通过实验验证上述结果是否准确,即BMPR2是否为mi R-100-3p的靶基因及BMPR2在胃癌中潜在作用。同时探讨mi R-100-3p—BMPR2作用的下游信号通路途径。研究目的:研究mi R-100-3p在胃癌细胞株以及胃癌组织和相对应的癌旁正常组织中的表达情况,并探讨mi R-100-3p在胃癌中的作用及下游的靶基因和作用机制。研究内容:第一部分mi R-100-3p在胃癌中低表达与作用1.用QRT-PCR检测胃癌细胞株SNU-1、MGC-803、AGS、SGC-7901、N87、MKN-28、HGC-27及永生化胃黏膜细胞GES-1,67例胃癌患者癌组织及相对应的癌旁正常组织中mi R-100-3p的表达情况。2.通过转染慢病毒敲低或者过表达mi R-100-3p研究mi R-100-3p生物学功能,在AGS细胞株中过表达mi R-100-3p,MGC-803细胞中敲低mi R-100-3p,随后:（1）MTT法检测AGS和MGC-803细胞株增殖情况,并绘制生长曲线图。（2）平板克隆检测AGS和MGC-803细胞株克隆形成能力变化。（3）流式细胞仪检测AGS和MGC-803细胞株的细胞周期变化。（4）Annexin V-PE-7ADD法检测AGS和MGC-803细胞株的凋亡情况（5）Transwell/Matrigel法观察AGS和MGC-803细胞株迁移和侵袭的能力。（6）软琼脂集落形成实验观察细胞独立性非锚啶生长能力。3.通过转录组学检测在AGS细胞株中转染Lv-mi R-100-3p-mimics,对比转染前后基因表达水平变化差异。4.统计分析mi R-100-3p与BMPR2在胃癌组织中表达水平的相关性。第二部分mi R-100-3p与BMPR2作用位点的预测和实验验证1.通过生物学软件预测位点,并通过双荧光酶素报告基因法验证结合位点。2.抑制或者过表达mi R-100-3p后通过QRT-PCR和WB检测BMPR2的变化。3.分析BMPR2与胃癌患者临床病理因素的相关性以及BMPR2与胃癌患者生存期的关系。4.在转染mi R-100-3p inhibitor的MGC-803细胞中,转染BMPR2 sh RNA行“rescue”后检测MGC-803细胞增殖、凋亡能力的变化。验证BMPR2sh RNA补救实验能否对下调mi R-100-3p的MGC-803细胞行为学的变化产生中和作用。5.在转染mi R-100-3p mimics的AGS细胞中,转染BMPR2过表达质粒行“rescue”,后检测AGS细胞增殖、凋亡能力的变化。验证BMPR2过表达质粒能否对上调mi R-100-3p的AGS细胞行为学的变化产生中和作用。6.探索mi R-100-3p-BMPR2影响细胞行为学的下游细胞信号通路。研究结果:第一部分1.与永生化的胃黏膜细胞GES-1相比,mi R-100-3p在胃癌细胞株呈低表达;在67例胃癌患者和相应的癌旁正常组织中,癌组织中mi R-100-3p显著低表达（p<0.0001）,mi R-100-3p表达水平与胃癌组织病理类型、淋巴结转移具有相关性,低分化胃癌患者表达水平较高-中分化胃癌水平低,淋巴结转移胃癌患者其表达水平较无淋巴结转移患者低,与分期、年龄等无相关性。2.转染mi R-100-3p mimics后显著抬高mi R-100-3p在AGS中表达水平,有效抑制胃癌细胞株的增殖、迁移、侵袭、克隆形成及软琼脂克隆形成能力,促进胃癌细胞发生凋亡。3.转染mi R-100-3p inhibitor后抑制mi R-100-3p在MGC803中功能,促进胃癌细胞株的增殖、迁移、侵袭、克隆形成,软琼脂克隆形成能力,抑制胃癌细胞发生凋亡。4.在AGS细胞中转染Lv-mi R-100-3p mimics,通过转录组分析发现转染后基因组中有222个基因出现表达下调,36个基因出现表达上调,BMPR2属于下调最明显基因之一,其表达水平与mi R-100-3p呈负相关,即高表达BMPR2患者,mi R-100-3p低表达。第二部分1.BMPR2与胃癌患者病理分型相关,低分化胃癌患者,BMPR2高表达,高分化胃癌患者,BMPR2低表达;BMPR2与胃癌患者生存相关,即高表达BMPR2的胃癌患者较低表达BMPR2的胃癌患者生存期短。2.生物信息学分析显示在BMPR2 m RNA3’UTR的5916-5923位置,1206-1212和7226-7232各存在一个与mi R-100-3p序列完全互补的“seed sequence”,5916-5923位置,具有一个与mi R-100-3p完全互补的8个碱基的种子序列;通过构建和转染BMPR2psi-CHECK2-Report-Luc质粒和mi R-100-3p mimic入AGS细胞,导致了较对照组显著的荧光强度变化,证实了BMPR2是mi R-100-3p的靶基因。3.过表达或者抑制mi R-100-3p水平,相应的BMPR2 m RNA和蛋白水平出现下降或者升高。4.转染BMPR2 shRNA或者过表达BMPR2后对下调或上调mi R-100-3p导致的细胞增殖、凋亡能力变化产生一定的中和效应。5.过表达mi R-100-3p有效降低了AGS细胞内BMPR2表达,并抑制了ERK-AKT通路蛋白磷酸化水平,促进细胞进入线粒体凋亡,转染BMPR2过表达质粒后有一定程度的抵消作用。6.过表达mi R-100-3p抑制了BMPR2-Smad1/5/9信号通路,转染BMPR2过表达质粒后有一定程度的抵消作用。7.抑制mi R-100-3p功能抬高了MGC-803细胞内BMPR2表达,并活化了ERK-AKT通路蛋白磷酸化水平,抑制细胞进入线粒体凋亡,转染BMPR2sh RNA质粒后有一定程度的抵消作用。8.抑制mi R-100-3p活化了BMPR2-Smad1/5/9信号通路,转染BMPR2sh RNA质粒后有一定程度的抵消作用。结论:1.mi R-100-3p低表达抑制了胃癌细胞凋亡发生,同时促进胃癌细胞侵袭、迁移、增殖和克隆形成能力,其在胃癌中发挥抑癌基因的作用。2.mi R-100-3p通过靶向抑制BMPR2的表达水平,进而影响ERK-AKT通路蛋白磷酸化水平介导的线粒体凋亡,该研究为胃癌的分子靶向治疗提供了新的线索。