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由Magnaporthe grisea引起的稻瘟病是严重为害水稻的重要病害之一,稻瘟菌已成为研究植物与植物病原真菌互作关系的模式菌。建立插入突变体库并筛选出突变体有助于研究稻瘟菌的功能基因和致病机理。 本研究利用限制性内切酶介导的整合技术构建了含有10334个转化体的稻瘟菌插入突变体库。其中用XhoI线性化质粒PV2转化小种Y34获得2200个转化体,用XhoI、ApaI、EcoRV分别线性化质粒PV2转化小种P131,分别获得2659、2517、228个转化体,用EcoRI线性化质粒pCB1004转化小种P131,获得2750个转化体。转化过程中发现用XhoI、ApaI、EcoRI转化效率差别不大,平均每皿可获得35-50个转化体,而EcoRV酶切形成的是平末端,平均每皿获得7个转化体,转化效率很低。 构建好突变体库后,作者通过洋葱表皮接种和水稻叶片活体接种的方法筛选突变体。筛选约7000个转化体后,获得18个突变体。其中突变体Mo938的产孢量减少,平均每皿产孢量是P131的5%左右,突变体Mo1745的分生孢子形状不规则,侵染钉减少。突变体Mo2424、EI2445在洋葱表皮上侵染钉形成率分别小于20%和1%。分别将这四个突变体接种水稻品种丽江黑谷叶片后,发现Mo1745、EI2445在叶片上不产生病斑,接有Mo2424的叶片上的病斑数比接有P131的叶片上的病斑数减少86.9%。 分别对Mo938、Mo1745、Mo2424和EI2445进行了共分离分析,结果发现Mo1745、Mo2424和EI2445为插入突变体,而Mo938的突变表型不是由于REMI转化过程中外源质粒的插入引起的。进一步通过Southern blot分析质粒在Mo1745的基因组中是单位点插入,但至少有两个拷贝,在Mo2424基因组中有两个插入位点,且每个位点都是单拷贝插入,与遗传分析结果一致。而通过Southern blot分析,质粒在EI2445基因组中为多位点插入,与遗传分析结果相矛盾。分析质粒在突变体基因组中的插入位点数和拷贝数为获得侧端序列和克隆基因奠定了基础。