论文部分内容阅读
非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均居我国城市居民恶性肿瘤之首。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)是治疗NSCLC的有效药物。目前临床应用的EGFR-TKI有吉非替尼与厄洛替尼,研究表明,EGFR突变阳性的NSCLC患者对EGFR-TKI的有效率为50-80%,在我国等亚洲地区EGFR-TKI对优势人群的疗效远远超过化疗的疗效,且仅有少许可耐受的不良反应而深受患者和医生的欢迎。根据IPASS研究的亚组分析提示,对于EGFR基因突变的患者采用吉非替尼,其无进展生存期(Progress Free Survival,PFS)优于标准含铂两药方案。从此根据分子标志物筛选特定的疾病人群,应用阻断此标志的化合物来抑制肿瘤生长已成为肺癌领域研发靶向药物的思路。但EGFR-TKI初始治疗有效的患者,随着治疗时间的延长,最终出现获得性耐药。继发性C-MET基因扩增致PI3K/AKt信号持续激活是导致EGFR-TKI获得性耐药的原因之一。因此,迫切需要探讨MET基因上、下游的调控因子。microRNA(miRNA,miR)是在真核生物中发现的一类小分子非编码RNA,在转录后水平调节基因表达。研究表明,miRNA作为类似癌基因和抑癌基因作用参与细胞增殖、凋亡和分化的调控,在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的生物学作用,且可能与肿瘤的耐药机制密切相关。miRNA-1在肿瘤的发生发展过程中起到抑癌基因的作用,提示通过提高miRNA-1表达来逆转EGFR-TKI获得性耐药在理论上是可行策略。另外凋亡抑制因子生存素(Survivin)除了参与细胞凋亡和增殖外,还可诱导耐药产生,且其表达受到PI3K/Akt信号通路调节,因此我们认为,Survivin可能在EGFR-TKI耐药中也起着重要作用。目的:EGFR-TKI药物厄洛替尼或吉非替尼是治疗非小细胞肺癌的有效药物,但其获得性耐药的出现限制了临床的应用。迄今为止,尚无理想的药物应用于临床克服肿瘤耐药。紫杉醇是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。通过Ⅱ-Ⅲ期临床研究,紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌,对肺癌、胃癌、食管癌、头颈部癌也都有一定疗效。但对肺癌耐药细胞株是否具有抑制效应及其作用的分子机制国内外尚未见相关研究报道。实验以肺癌耐药细胞为对象,研究紫杉醇对细胞耐药性的影响及其机制,探讨紫杉醇对肺癌耐药的潜在治疗作用,并通过检测一例经过吉非替尼治疗耐药患者的血浆中在吉非替尼治疗前、紫杉醇化疗前(吉非替尼耐药)、紫杉醇化疗后(恢复敏感)的miRNA-1含量来对体外实验进行验证。本研究同时检测了肺癌人血浆miRNA-1与对照组(健康人、食管癌)的表达变化差异。方法:1.H1975、H820为EGFR-TKI获得性耐药细胞株,PC-9细胞为EGFR-TKI敏感细胞株,A549为EGFR-TKI原发性耐药细胞株。且H1975细胞为EGFR L858R-T790M突变型;H820细胞具有MET扩增;A549细胞表达野生型EGFR基因。紫杉醇作用于肺癌细胞株H1975、H820、A549和PC-9细胞48h后,采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率。2.流式细胞术(FCM)检测紫杉醇对四株细胞凋亡率的影响;3.免疫蛋白印迹技术分析紫杉醇对四株细胞中MET蛋白、p-Akt蛋白,Survivin蛋白的表达影响。4.实时定量PCR检测应用紫杉醇作用前后肺癌细胞株H1975、H820、A549和PC-9细胞miRNA-1的表达变化。5.实时定量PCR检测一例经吉非替尼治疗耐药的临床患者应用紫杉醇作用前后血浆中miRNA-1的表达变化。6.实时定量PCR检测应用肺癌人血miRNA-1与对照组(食管癌、健康人)的表达变化。结果:1.MTT检测结果显示紫杉醇对H1975、H820、A549和PC-9细胞生长有明显的抑制作用。2.流式细胞检测显示紫杉醇能够显著诱导细胞凋亡。3.Western blot检测发现,紫杉醇能够抑制MET、p-Akt、survivin的表达。4.Real-time PCR检测发现:紫杉醇作用后miRNA-1基因在H1975、PC-9和H820三株细胞中的表达上调,A549细胞中无明显变化。相关分析发现miRNA-1与MET、p-Akt,Survivin三者之间具有相关性。5.Real-timePCR检测发现:紫杉醇作用后miRNA-1基因在人血中的表达下调。6.Real-time PCR检测发现:肺癌人血miRNA-1的表达明显高于对照组(健康人、食管癌)。结论:1.紫杉醇上调H1975、PC-9和H820细胞miRNA-1的表达可能导致MET、p-Akt、Survivin的表达水平的明显减低。2.紫杉醇可能通过上调miRNA-1的表达使对EGFR-TKI耐药的NSCLC患者恢复敏感。3.miRNA-1可以作为肺癌的分子标志物。