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【背景和目的】克罗恩病(Crohn’s disease,CD)与溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)被称为炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD),病变遍及全消化道,发病机制尚不清楚,极大的阻碍了其彻底治愈,开展相关研究,将为我国IBD的发病机制研究、临床诊断和治疗提供服务,具有重要的科学意义。其病因不明,现普遍认为IBD是遗传易感个体对肠腔内容物(如细菌、食物)的不恰当免疫反应的结果。除了肠道微生态的失衡以外,大肠杆菌在IBD的发病中起重要作用。黏附侵袭性大肠杆菌(adherent-invasive Escherichia coli,AIEC)为最受关注的IBD可能致病菌之一。在IBD发生发展的过程中AIEC是否参与犹未可知。近年发现的Th17细胞参与炎症性肠病(IBD)等多种自身免疫性炎症性疾病的发生发展,其分泌的IL-17在其中起关键作用。然而IL-17对IBD似乎起致病和保护的双重作用,其中的机制仍未阐明。缺乏IL-17的个体感染AIEC会产生何种结果,AIEC是否可通过Th17细胞加重IBD尚不清楚。本研究旨在明确模式动物及相关体内外实验揭示Th17细胞的分化调控在AIEC加重的肠道炎症中的作用和机制,项目的开展将有助于明确IBD的发病机制,具有重要科学意义。【方法】1.向C57BL/6J野生小鼠灌胃,连续十天给予1×109CFU/天E.coli LF82,观察E.coli LF82对结肠上皮屏障完整性的影响。通过HE染色观察小鼠结肠病理组织学改变;通过通过透射电镜和扫描电镜观察小鼠结肠超微结构和细胞骨架的变化;通过ELISA研究E.coli LF82对小鼠结肠中炎症细胞因子的影响;通过免疫组织化学和PCR检测实验小鼠结肠内的IL-17表达,检验E.coli LF82是否引起IL-17的变化。同样对IL-17敲除鼠给予连续十天1×109CFU/天E.coli LF82。观察E.coli LF82对结肠上皮屏障完整性的影响。通过通过透射电镜和扫描电镜观察小鼠结肠超微结构和细胞骨架的变化;通过HE染色观察小鼠结肠病理组织学改变;通过ELISA研究E.coli LF82定植后小鼠结肠中炎症细胞因子的变化,探讨IL-17在E.coli LF82对小鼠结肠黏附侵袭中的作用。2.建立实验性结肠炎模型,给予实验动物1×109CFU/天E.coli LF82灌胃十天,然后用3%DSS造小鼠结肠炎模型,通过体重和小鼠结肠长度、HE病理组织学表现三个方面来研究E.coli LF82对结肠炎症的影响作用。通过Bio-plex测定结肠组织中炎症细胞因子的变化,通过免疫组织化学和PCR检测实验小鼠结肠内的IL-17表达证实IL-17是否影响E.coli LF82的对结肠炎的影响。3.IL-17基因敲除小鼠也建立同样的实验性结肠炎模型。通过体重和小鼠结肠长度、HE病理组织学表现比较肠道定植了E.coli LF82以后野生型小鼠和IL-17基因敲除小鼠实验性结肠炎的炎症程度,探讨IL-17是否影响定植了E.coli LF82的小鼠结肠炎。通过Bio-plex测定IL-17基因敲除小鼠结肠组织中炎症细胞因子的变化。【结果】1.通过HE染色的病理切片发现定植的E.coli LF82可导致野生型小鼠结肠上皮细胞轻微紊乱和炎性细胞浸润明显,接下来通过PCR和免疫组化发现定植了E.coli LF82的野生型小鼠的结肠组织中IL-17的分泌量升高。相比定植了E.coli LF82的野生型小鼠,IL-17敲除鼠定植E.coli LF82后结肠上皮细胞更紊乱,炎性细胞浸润也更加明显。透射电镜显示定植E.coli LF82以后,野生型小鼠肠上皮细胞微绒毛排列有序,而IL-17敲除鼠结肠上皮细胞微绒毛大量脱落。进一步通过透射电镜和扫描电镜研究发现在IL-17敲除鼠的结肠组织中,E.coli LF82不仅损伤结肠上皮细胞微绒毛,还以胞吞的方式侵袭到结肠上皮细胞,而野生型小鼠则没有观察到以上现象。2.通过体重和小鼠结肠长度指标评价发现E.coli LF82对DSS诱导野生型小鼠结肠炎症炎症程度并无影响,小鼠结肠组织学评分也没有差别。在DSS诱导野生型小鼠结肠炎症中,PCR和免疫组化发现E.coli LF82使结肠中IL-17含量升高。接着通过急性活动相关性和组织学评分发现,在IL-17敲除小鼠的实验性结肠炎中E.coli LF82加重了DSS诱导IL-17敲除小鼠的结肠炎症;相比定植E.coli LF82对野生型小鼠实验性结肠炎症的影响,E.coli LF82明显加重了IL-17敲除小鼠的DSS诱导结肠炎症程度。3.此外通过检测结肠组织炎症因子发现,在普通肠道相比野生型小鼠,E.coli LF82的定植使IL-17敲除小鼠结肠中IL-22的分泌降低。在小鼠实验性结肠炎中,E.coli LF82可进一步降低DSS诱导IL-17敲除小鼠结肠中IL-22的分泌释放。说明IL-17能够促进IL-22分泌。【结论】我们的研究证实E.coli LF82可引起小鼠结肠炎症,定植了E.coli LF82的野生型小鼠的结肠组织中IL-17的分泌量升高。在IL-17缺乏时,E.coli LF82可进一步破坏小鼠肠上皮屏障完整性。在DSS诱导实验性野生型小鼠结肠炎中,E.coli LF82也可刺激小鼠结肠IL-17分泌增加;而在IL-17敲除小鼠中,E.coli LF82也可加重DSS诱导的小鼠结肠炎症,表明在IL-17缺乏时,E.coli LF82可加重炎症;在定植了E.coli LF82后,与野生型小鼠小鼠相比,IL-17敲除小鼠DSS诱导炎症程度加重,表明在E.coli LF82定植后,IL-17缺乏时可加重炎症。进一步证实IL-17在定植了E.coli LF82的DSS诱导的炎症中有保护作用。进一步研究其中的机制发现IL-17可能是通过促进炎症保护性细胞因子IL-22分泌,共同保护结肠肠上皮屏障。