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目的探讨解偶联蛋白2减缓高糖加重缺氧导致的神经元损伤的作用,初步阐明其与线粒体分裂/融合的关系。方法本实验利用高糖联合缺氧和高乳酸模拟在体糖尿病/高血糖合并脑缺血损伤状态。为验证糖尿病/高血糖状态缺氧对HT22细胞的损伤作用和对ROS产生的影响,将体外培养海马神经细胞(HT22)分为:(1)对照组;(2)高糖组:30、40、50和60m M葡萄糖干预HT22细胞;干预24h后,分别缺氧0h和缺氧4h后复氧0、6、12和18h。(3)正常血糖缺氧组:HT22细胞;正常培养后,分别缺氧0h和缺氧4h后复氧0、6、12和18h。(4)高糖缺氧组:30、40、50和60m M葡萄糖干预HT22细胞;干预24h后,分别缺氧0h和缺氧4h后复氧0、6、12和18h。(5)高乳酸组:2.5、5、7.5和10m M乳酸干预HT22细胞24h。倒置显微镜观察细胞形态学改变;DCFH-DA探针检测ROS生成情况;为探讨UCP2对高糖状态缺氧神经元损伤的减缓作用,及与ROS生成,线粒体分裂/融合关系,利用UCP2转染的海马神经元细胞(UCP2)和相应空载体转染的海马神经元细胞(HT-NC)进行实验。分为以下组:(1)HT-NC对照组;(2)HT-NC高糖缺氧组;(3)UCP2对照组;(4)UCP2高糖缺氧组。高糖状态缺氧处理:50m M高糖干预24h后,缺氧4h立即复氧12h,CCK-8法检测细胞活性率;倒置显微镜观察细胞形态学改变;DCFH-DA探针检测ROS生成情况;免疫荧光化学和Western-blotting检测线粒体分裂/融合相关因子OPA1、Mfn2、Fis1和Drp1及凋亡执行因子Cleaved Caspase-3在不同组细胞中的表达;流式细胞仪检测不同组细胞凋亡。研究结果第一部分结果:(1)CCK-8法测细胞活性率,不同浓度高糖和高乳酸可导致HT22细胞活性率下降,细胞损伤呈剂量依赖性。与对照组相比较,50m M高糖组和5m M高乳酸组活性率显著下降(P<0.05);缺氧各组较对照组活性率明显下降(P<0.05)。(2)对照组HT22细胞形态正常,胞膜、胞核完整;各干预可见凋亡细胞增多,凋亡细胞胞核和胞膜破裂。(3)ROS检测结果显示,与对照组相比较,高糖、高乳酸组及缺氧各组ROS产生明显增加(P<0.05)。(4)Western-blotting结果显示:与对照组相比较,各干预组Cleaved Caspase-3表达明显升高(P<0.05)。第二部分结果:(1)CCK-8法测细胞活性率,UCP2高糖缺氧组细胞活性率较UCP2对照组降低(P<0.05);与HT-NC高糖缺氧组相比较,UCP2高糖缺氧组细胞活性率明显升高(P<0.05)。(2)对照组细胞形态正常;HT-NC高糖缺氧组凋亡细胞增多,胞核碎裂,细胞呈多角形,胞膜破裂。UCP2高糖缺氧组细胞形态相对正常,偶见凋亡细胞,较HT-NC高糖缺氧组明显减少。(3)ROS检测结果显示,与对照组相比较,HT-NC高糖缺氧组ROS产生显著增加,UCP2高糖缺氧组ROS产生较HT-NC高糖组明显减少。(4)免疫荧光化学及Western-blotting结果显示:与对照组相比较,HT-NC高糖缺氧组OPA1和Mfn2表达明显减少,而Fis1、Drp1及Cleaved Caspase-3表达明显增加(P<0.05);UCP2高糖缺氧组OPA1和Mfn2表达较HT-NC高糖组明显增加,而Fis1、Drp1及Cleaved Caspase-3表达较HT-NC高糖缺氧组明显减少(P<0.05)。(5)流式细胞仪测细胞凋亡,UCP2高糖缺氧组凋亡细胞较HT-NC高糖缺氧组明显减少(P<0.05)。结论(1)高糖联合缺氧可加重缺氧性神经细胞损伤,增加ROS产生;(2)高乳酸可损伤神经细胞,促进ROS产生;(3)ROS产生增多参与了高糖加重的缺氧性神经细胞损伤;(4)高表达UCP2可以通过减少ROS生成和稳定线粒体分裂/融合过程减缓高糖加重缺氧性神经元损伤发挥脑保护作用;