Bt基因与GNA基因融合基因的构建、表达及其生物活性研究

• 作 者: 许静
• 机 构: 华中农业大学
• 出 处: 华中农业大学
• 发表日期: 2009年01期
• 关键词: 水稻 苏云金芽孢杆菌 抗虫融合基因 原核表达载体 生物活性 雪花莲外源凝集素

水稻在生长过程中受到多种害虫的危害，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前应用最多的杀虫微生物。自从1987年报道第一例转基因作物以来，已经有很多水稻品系转入了各种Bt cry基因，并能对鳞翅目害虫表现出抗性。但尚没有发现一种Bt基因对水稻同翅目重要害虫如褐飞虱（Nilaparvata lugens）等有杀虫活性。同时，害虫可能会对Bt产生抗性。尽管还没有在大田实验中害虫表现对转Bt水稻抗性的报道，但在室内实验中，已经有害虫表现出了对Cry蛋白的抗性。构建抗虫融合基因会是一种新的有效的方法用以解决这些问题。　　
雪花莲外源凝集素（Galanthus nivalis agglutinin，GNA）是一种甘露糖专一识别的植物凝集素。研究表明人工喂食GNA和转GNA作物都对飞虱表现出一定的毒力。所以，GNA为可以作为一个很好的候选基因用以和Bt构成融合基因。为此，本研究将Bt杀虫蛋白CrylAc结构域Ⅰ部分基因序列与成熟GNA蛋白基因序列进行融合，以期使其表达一种对鳞翅目和同翅目害虫均具有良好抗虫活性的新的杀虫蛋白。获得的主要研究结果如下：　　
1．首先分别单独克隆出CrylAc结构域Ⅰ部分基因序列与成熟GNA蛋白基因序列，再连接到克隆载体pCR2.1上，构建融合基因（CrylAc/GNA）。将融合基因克隆到原核表达载体pET11a上，即pET11a-CrylAc-GNA，再转化大肠杆菌（Escherichia coli，E．coli）。结果显示能够表达得到含有GNA成熟蛋白结构和CrylAc蛋白结构域Ⅰ的融合蛋白。经凝血活性测定表明该融合蛋白具有凝血活性。另外，生物测定实验也表明融合蛋白对褐飞虱仍保持有GNA蛋白应具有的杀虫活性。　　
2．设计引物从含有融合基因的pET11a载体上分别PCR扩增出融合基因、单独的CrylAc基因和单独的GNA基因，再连接到T载体上，转化大肠杆菌E．coli。经过检验测定后，将三个基因分别克隆到植物表达载体pCAMBIA1300s上，即构建了转化载体pCAMBIA1300s-CrylAc-GNA，pCAMBIA1300s-CrylAc，pCAMBTA1300s-GNA，并成功转化农杆菌EHA105。　　
3．通过共侵染法将三个转化载体转化水稻粳稻品系中花11，目前已经得到转融合基因的抗性愈伤。