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利用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR)技术,从猪瘟病毒Shimen株细胞毒中克隆出P80 基因,并进一步把P80 基因连接在真核表达载体pEGFP-C1 上,成功地构建出P80 基因重组真核表达质粒(pEGFP-P80),为在哺乳动物细胞中表达并纯化出p80 蛋白奠定了基础。接着,把构建好的重组质粒pEGFP-P80 在PK-15 细胞中进行表达来研究p80 蛋白对PK-15 细胞的致病变作用,为研究p80 蛋白与猪源细胞发生CPE 效应之间的联系进行了探讨。1.参考已经发表的猪瘟病毒Alfort 株和Brescia 株的全基因组序列,设计2 对引物P1/P2 和B1/B2,在B1 和B2 的5’ 端分别引入Xho I 和Apa I 酶切位点,使用RNA 一步提取试剂盒,利用RT-PCR 和nPCR技术,成功地从猪瘟Shimen株细胞毒中扩增出约2.0kb 大小的P80 基因。将PCR 产物分离、纯化并与克隆载体pMD 18-T 连接,然后进行核苷酸序列测定和PCR、Bamh I /Hind Ⅲ双酶切的鉴定,结果表明其为P80 基因的重组质粒(pMD-P80)。将pMD-P80 分别经Xho I 和Apa I 双酶切和回收,然后与经过Xho I 和Apa I 酶解的真核表达载体pEGPF-C1 连接、转化,获得重组质粒,经PCR,Xho I 和Apa I 限制性酶切和序列测定,鉴定为真核表达质粒pEGFP-P80,并且目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确,为在哺乳动物细胞中表达并分离纯化p80 蛋白奠定了基础。2.利用阳性脂质体L2000 介导,在六孔细胞培养板中,将已经构建好的pEGFP-P80重组表达质粒转染到PK-15 细胞中进行表达。在转染后6h,利用荧光显微镜监测到发出绿色荧光的融合蛋白;在转染后24h,利用免疫组化SABC 法检测到目的蛋白p80。结果表明,重组表达质粒pEGFP-P80 可以在PK-15 细胞中表达出有免疫活性的p80 蛋白。重复转染操作,在96 孔细胞培养板中,将pEGFP-P80 重组表达质粒和空质粒pEGFP-C1 分别转染到PK-15 细胞中进行表达。分别在转染后24h、48h 对转染了pEGFP-P80 质粒的细胞组和转染了空质粒pEGFP-C1 的细胞组进行MTT 比色,测定OD值,并进行两组细胞活性分析。结果表明,利用pEGFP-P80 重组表达质粒在PK-15 细胞中表达出的p80 蛋白未对宿主细胞有明显的致病变作用。