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2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）是由于机体组织和器官的代谢紊乱造成。肝脏、肌肉及脂肪组织已被广泛研究。胃肠道作为与糖尿病病理机制密切相关的重要器官，在 2 型糖尿病等代谢疾病中的研究中较少涉及。肠道内分泌细胞 L 细胞产生的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）作为一种重要的肠促胰岛素激素，有助于血糖稳态的调节和食物的摄取，并与T2DM的发病机制息息相关。近年，研究显示，来自肠道细菌产物的脂多糖（LPS），一种Toll样受体4（TLR4）的天然配体，可以诱导实验动物及人体GLP-1的分泌，提示TLR4或许参与了生理状态下GLP-1分泌的调节。
本研究拟通过LPS引起的野生型小鼠TLR4活化及TLR4敲除小鼠造成的TLR4缺乏来观察TLR4对葡萄糖诱导的GLP-1分泌的影响，以更深入地了解生理性GLP-1分泌调节机制，及T2DM餐后GLP-1释放钝化的病理学机制，以寻找新的T2DM治疗靶点。
首先，本实验对 TLR4 敲除小鼠和野生小鼠进行基因型的验证，以确保实验的严谨性。结果显示，所用实验小鼠均符合所要求的TLR4敲除基因型。为了了解TLR4激活对葡萄糖诱导的GLP-1分泌的影响，给小鼠腹腔内单次腹腔注射TLR4的天然配体LPS（2mg / kg）以激活TLR4。生理盐水注射作为对照。然后，在不同时间给小鼠灌胃25%葡萄糖（10g/kg），采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定血浆中各个时间点上GLP-1水平，以观察葡萄糖引起的血浆GLP-1水平的改变。为了解其水平的改变是否相关于血液中 GLP-1 水解酶二肽基肽酶 4 （DPP-4），也同时分析了DDP-4的活性。结果显示，与正常对照小鼠相比，LPS注射24h内，葡萄糖诱导的血浆GLP-1水平在30min （第一相分泌）和90min (第二相分泌)显著增加（P<0.01）。但是，LPS注射后48h，葡萄糖并不引起30min和90min时间点血浆GLP-1水平增加。蛋白质免疫印记（Western blot）分析也表明，LPS处理48小时后， GLP-1蛋白表达显著低于LPS处理后的其他时间点（P<0.05）。而DPP-4在LPS处理小鼠和对照小鼠之间的各个时间点上没有显著变化。提示LPS引起的TLR4活化显著影响了生理性GLP-1的分泌。
接下来在TLR4敲除小鼠观察了TLR4缺乏对葡萄糖诱导的GLP-1分泌的影响以及LPS对TLR4敲除小鼠中葡萄糖诱导GLP-1分泌的影响。TLR4敲除小鼠被灌胃25%葡萄糖（10g/kg），运用ELISA法检测30min 和 90min 时血浆 GLP-1 的水平。结果表明，TLR4 敲除小鼠在30min和90min时没有表现出血浆GLP-1水平的增加，在每个时间点与野生型小鼠显著不同。 与此同时，实验还观察了LPS处理对TLR4敲除小鼠中葡萄糖诱导的GLP-1分泌的影响。在LPS处理后6h，TLR4敲除小鼠在葡萄糖负荷之前和之后没有表现出血浆 GLP-1 水平的增加。 血浆DPP-4活化在各组中没有显著差异。此外，蛋白质免疫印记（Western blot）分析显示TLR4敲除小鼠的GLP-1蛋白表达水平显著低于野生小鼠，提示了TLR4参与了葡萄糖依赖的GLP-1分泌的调节。
TLR4的作用主要依赖于其活化导致的炎性因子的产生，特别是促炎细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）与GLP-1分泌密切相关。为了进一步了解TLR4影响葡萄糖诱导GLP-1分泌的机制，接下来运用ELISA法检测了各种情况下血浆及回肠组织促炎细胞因子TNF-α和IL-6的水平变化。结果表明，LPS处理首先导致野生型小鼠血浆中IL-6水平升高，并在6h达到高峰，随后TNF-α水平升高，在12h达到峰值；回肠组织中IL-6和TNF-α水平与血浆变化基本一致。可是，TLR4缺乏小鼠及LPS处理的TLR4敲除小鼠血浆及回肠组织IL-6和TNF-α水平改变并不升高，提示了炎性因子参与了GLP-1分泌的调节。
早期阶段LPS处理导致的GLP-1分泌增加机制已有了解。但是晚期阶段GLP-1分泌抑制的机制尚不清楚。为此，实验中应用抗炎性因子抗体观察了炎性因子的耗竭对葡萄糖诱导的GLP-1水平的影响。结果表明，抗TNF-α抗体显著逆转了48h的GLP-1释放抑制，表明TNF-α在48h葡萄糖诱导的GLP-1分泌抑制中起关键作用。
总之，本研究显示，TLR4对葡萄糖依赖性GLP-1的生理分泌可能是必需的; LPS诱导的TLR4过度激活对葡萄糖依赖性GLP-1分泌有不同的影响，其早期的促进作用，及晚期的抑制作用。晚期GLP-1分泌的抑制是由于TNF-α水平升高的作用。这些发现扩展了关于葡萄糖依赖的生理性GLP-1分泌机制的认识，也有助于解释T2DM和肥胖个体中饮食引起的GLP-1分泌受损。
本研究拟通过LPS引起的野生型小鼠TLR4活化及TLR4敲除小鼠造成的TLR4缺乏来观察TLR4对葡萄糖诱导的GLP-1分泌的影响，以更深入地了解生理性GLP-1分泌调节机制，及T2DM餐后GLP-1释放钝化的病理学机制，以寻找新的T2DM治疗靶点。
首先，本实验对 TLR4 敲除小鼠和野生小鼠进行基因型的验证，以确保实验的严谨性。结果显示，所用实验小鼠均符合所要求的TLR4敲除基因型。为了了解TLR4激活对葡萄糖诱导的GLP-1分泌的影响，给小鼠腹腔内单次腹腔注射TLR4的天然配体LPS（2mg / kg）以激活TLR4。生理盐水注射作为对照。然后，在不同时间给小鼠灌胃25%葡萄糖（10g/kg），采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定血浆中各个时间点上GLP-1水平，以观察葡萄糖引起的血浆GLP-1水平的改变。为了解其水平的改变是否相关于血液中 GLP-1 水解酶二肽基肽酶 4 （DPP-4），也同时分析了DDP-4的活性。结果显示，与正常对照小鼠相比，LPS注射24h内，葡萄糖诱导的血浆GLP-1水平在30min （第一相分泌）和90min (第二相分泌)显著增加（P<0.01）。但是，LPS注射后48h，葡萄糖并不引起30min和90min时间点血浆GLP-1水平增加。蛋白质免疫印记（Western blot）分析也表明，LPS处理48小时后， GLP-1蛋白表达显著低于LPS处理后的其他时间点（P<0.05）。而DPP-4在LPS处理小鼠和对照小鼠之间的各个时间点上没有显著变化。提示LPS引起的TLR4活化显著影响了生理性GLP-1的分泌。
接下来在TLR4敲除小鼠观察了TLR4缺乏对葡萄糖诱导的GLP-1分泌的影响以及LPS对TLR4敲除小鼠中葡萄糖诱导GLP-1分泌的影响。TLR4敲除小鼠被灌胃25%葡萄糖（10g/kg），运用ELISA法检测30min 和 90min 时血浆 GLP-1 的水平。结果表明，TLR4 敲除小鼠在30min和90min时没有表现出血浆GLP-1水平的增加，在每个时间点与野生型小鼠显著不同。 与此同时，实验还观察了LPS处理对TLR4敲除小鼠中葡萄糖诱导的GLP-1分泌的影响。在LPS处理后6h，TLR4敲除小鼠在葡萄糖负荷之前和之后没有表现出血浆 GLP-1 水平的增加。 血浆DPP-4活化在各组中没有显著差异。此外，蛋白质免疫印记（Western blot）分析显示TLR4敲除小鼠的GLP-1蛋白表达水平显著低于野生小鼠，提示了TLR4参与了葡萄糖依赖的GLP-1分泌的调节。
TLR4的作用主要依赖于其活化导致的炎性因子的产生，特别是促炎细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）与GLP-1分泌密切相关。为了进一步了解TLR4影响葡萄糖诱导GLP-1分泌的机制，接下来运用ELISA法检测了各种情况下血浆及回肠组织促炎细胞因子TNF-α和IL-6的水平变化。结果表明，LPS处理首先导致野生型小鼠血浆中IL-6水平升高，并在6h达到高峰，随后TNF-α水平升高，在12h达到峰值；回肠组织中IL-6和TNF-α水平与血浆变化基本一致。可是，TLR4缺乏小鼠及LPS处理的TLR4敲除小鼠血浆及回肠组织IL-6和TNF-α水平改变并不升高，提示了炎性因子参与了GLP-1分泌的调节。
早期阶段LPS处理导致的GLP-1分泌增加机制已有了解。但是晚期阶段GLP-1分泌抑制的机制尚不清楚。为此，实验中应用抗炎性因子抗体观察了炎性因子的耗竭对葡萄糖诱导的GLP-1水平的影响。结果表明，抗TNF-α抗体显著逆转了48h的GLP-1释放抑制，表明TNF-α在48h葡萄糖诱导的GLP-1分泌抑制中起关键作用。
总之，本研究显示，TLR4对葡萄糖依赖性GLP-1的生理分泌可能是必需的; LPS诱导的TLR4过度激活对葡萄糖依赖性GLP-1分泌有不同的影响，其早期的促进作用，及晚期的抑制作用。晚期GLP-1分泌的抑制是由于TNF-α水平升高的作用。这些发现扩展了关于葡萄糖依赖的生理性GLP-1分泌机制的认识，也有助于解释T2DM和肥胖个体中饮食引起的GLP-1分泌受损。