对氧磷酶1的表达纯化及其活性与功能的初步研究

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对氧磷酶1(Paraoxonase1,PON1)是对氧磷酶(PON)家族的成员之一,它是鸟类和哺乳动物体内存在的一种广谱非专一性酯酶,能够通过催化磷酸酯键的水解来降解氨基甲酸酯、有机磷酸酯和芳香羧酸酯,从而对水解有机磷类化合物及降解神经毒剂发挥重要的作用。PON1也正是取自其特殊的毒理学意义。当前越来越多的证据表明PON1不仅在催化有机磷水解方面作用巨大,而且在哺乳动物的脂质代谢中也扮演着非常重要的角色,因此PON1与有机磷中毒、动脉粥样硬化、冠心病以及Ⅱ型糖尿病等多种疾病的发生与发展等有密切的关系。本研究成功构建了PON1的重组表达菌株pET-32a-PON1,并用IPTG诱导表达出目的蛋白PON1。经过Ni-NTA亲和层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析等一系列纯化后,得到纯度达90%以上的目的蛋白。利用纯化后的PON1蛋白免疫新西兰雄兔制备多克隆抗体为纯化家蚕生物反应器中表达的PON1奠定基础。同时利用家蚕杆状病毒表达系统成功构建了重组杆状病毒vBmPON1。将此病毒接种家蚕五龄幼虫及蚕蛹,待其发病后,收集血淋巴对其进行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析,结果表明目的蛋白PON1在家蚕BmN细胞、五龄幼虫及蚕蛹中均得到成功表达。利用对氧磷为底物将家蚕生物反应器系统表达的PON1、大肠杆菌表达的PON1及家兔血清中天然存在的PON1分别进行体外活性检测。另外,我们对PON在小鼠体内对敌敌畏的水解效果进行了探索与比较,为今后进一步研究家蚕生物反应器表达的PON1的生物活性及在生物体内的功能机制奠定了基础。
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