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番木瓜(Carica papaya L.)作为一种典型的呼吸跃变型果实,具有成熟软化快、货架期短的问题。因此,研究番木瓜果实的成熟软化机理具有重要的理论和实践意义。P.甘露聚糖酶(endo-β-mannanase,EC3.2.1.78)是降解甘露聚糖或含甘露聚糖的多糖水解酶之一。甘露聚糖是普遍存在于植物细胞壁中的一种半纤维素成分,故细胞壁的降解涉及甘露聚糖的降解。而果实成熟软化涉及细胞壁的降解。因此,β-甘露聚糖酶可能与果实的成熟软化有关。本文以夏威夷小番木瓜品种“穗优2号”为材料,克隆果实中的β-甘露聚糖酶基因,运用生物信息学手段分析亲缘关系较近的几个物种间该基因的同源性,并通过实时荧光定量PCR来初步探索该酶基因在正常成熟和1-MCP抑制成熟的果实中不同成熟阶段的基因表达情况。同时通过凝胶扩散法检测对应成熟阶段的酶活性变化情况,为阐明β-甘露聚糖酶在番木瓜果实成熟软化中的作用机理奠定基础。结果如下:
采用凝胶扩散及刚果红染色法,测定正常成熟以及1-MCP处理的番木瓜果实在不同成熟阶段的β-甘露聚糖酶活性。结果发现,两组材料中的酶活性在采后初期活性增长趋势均平缓且差别不大。对照组中,当第7天番木瓜果肉硬度明显下降的时候,β-甘露聚糖酶活性增加幅度变大。而1-MCP处理组果实硬度从采后第8天出现较为明显的下降,对应的酶活性也出现较大幅度增长。
为了从分子水平探索β-甘露聚糖酶与番木瓜果实成熟软化的相互关系,本实验克隆了β-甘露聚糖酶基因,并命名为CpMAN1。根据不同植物物种中已经报道的β-甘露聚糖酶基因,在NCBI上搜索已经发表的番木瓜中β-甘露聚糖酶基因的EST序列,利用软件电子克隆得到一条可能为番木瓜β-甘露聚糖酶基因的序列。根据该序列设计特异性引物,从番木瓜果实中克隆得到一条长836bp的β-甘露聚糖酶基因片段,并采用3-RACE技术克隆得到该片段的3端序列。将得到的序列与数据库中其他物种的β-甘露聚糖酶基因序列进行同源性比对,发现番木瓜果实的β-甘露聚糖酶基因与番茄、大豆、莴苣、胡萝卜等物种的β-甘露聚糖酶基因具有相当高的同源性。通过序列分析本实验克隆的酶基因,发现该核苷酸序列预测的氨基酸序列与糖苷水解酶家族5对应的氨基酸序列相似性最高,达到62％。说明本文克隆到的基因序列属于糖苷水解酶家族5。
为了准确分析该酶基因在番木瓜果实中的表达模式,以两组处理不同成熟阶段的番木瓜果实总RNA为模板,进行实时荧光定量PCR。结果表明,β-甘露聚糖酶基因在番木瓜果实不同成熟阶段的表达存在差异。变化趋势为:采前β-甘露聚糖酶基因表达量维持较高水平,采后初期下降,之后逐渐升高。在1-MCP处理组中,该酶基因表达模式与对照组不同。
本研究在番木瓜果实中克隆到β-甘露聚糖酶基因,并进行表达分析。最终结果表明,β-甘露聚糖酶参与番木瓜果实成熟软化过程。