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人类红细胞的血红蛋白是由α-珠蛋白基因簇编码的两条珠蛋白肽链及β-珠蛋白基因簇编码的两条珠蛋白肽链组成的四聚体。α基因簇位于16号染色体，含四个功能基因，依次为5’-ζ-α1-α2-θ-3’；β基因簇位于11号染色体，含5’-ε-Gγ-Aγ-δ-β-3’五个功能基因。人类各珠蛋白基因表达具有一定的时间性及空间性，对每一类基因，某一阶段仅表达一个或以一个基因表达为主。当某一基因发生突变，其转录效率，mRNA的稳定性，及编码功能等都可能不同程度地发生异常，并可能影响同簇其它基因的表达。地中海贫血即是因珠蛋白基因异常而引起的一种主要在儿童期起病的遗传性溶血性贫血。人们根据突变珠蛋白基因的不同而将其分为α-，β-，δβ-，及γδβ-地贫等四种类型。本病在地中海沿岸，东南亚及我国的广东，广西，四川等地高发，对儿童健康影响很大，目前尚无有效的治疗手段。对突变基因，正常基因的研究，有望为临床治疗疾病提供理论基础。 近年来，随着分子生物学的快速发展，人们在基因水平已对地中海贫血的分子机制进行了深入而广泛的研究。而基因工程技术的日渐完善，亦为人们研究珠蛋白基因调控机制提供了有效的手段，这些均使人们日益注重基因转录表达的研究。为此，一个行之有效的检测珠蛋白基因转录水平的方法迫切需要建立。 国外已往的研究，多采用RT-PCR法，亦有采用探针法对珠蛋白基因转录水平进行定量。但每次仅局限于2-4种珠蛋白基因，在同时研究各种类型地中海贫血甚至复合型地中海贫血的致病机制，及全面系统地研究珠蛋白基因表达切换规律，研究基因调控机制等时，其应用即受到限制。而国内在此领域的研究开展得不多。目前尚未见同时对七种珠蛋白基因转录水平进行监测的报道。 本研究的目的即是建立一个能同时对7种珠蛋白基因（α，β，Aγ，Gγ，δ，ε，ζ）转录水平进行定量的方法。由于探针定量法RNA需量大，尤其对儿童不适宜，且RNA易降解，操作时条件要求高，因此我们D 选用盯－pCR t作为定量方汪。Dl 在外周血中含量高，尚含RNA，故被用于珠蛋白某因转录的研究中。在lD 本研冤中我们宜先对外周血网织红细胞的分离方法进行了改良，配制出DD 一种可高产量分离网织红细胞的细胞分离液，并将与常用的淋巴细胞分Dl 离液相比较，证明效果好，产量高。我们又对细胞质 NA提取方法进行 lDJ叹臣，经勺并腑氰限肌活比牧，显不广重同，和盯少，且N＠叮捉脐DD 口＊A，尤耳适用于地窗等需同肘对其某因水平讲行定体研究时。巾干同DD 族坏蚤曰基凶的问源性很局，在拨计引物时，除考虑W密码于的兼Dl 最终自行设计出 13条共七对引物，经基因库拟合，确证特异。且产物片 lD 段众皮与狈朋阴一致。在硼定仅匝怀杀组成过程中，多次对＊才”浓度进DD 行调整，最终确定 17．5－20mM为适宜浓度。在 PCR参数选择上，经多次 Dl＆索条件，当 94’C，50’C及 72’C各 lmin时，即可全部扩增出 7种产物，lD 优化实验条件时。将每个循环的退火时间缩短30s。。，延伸时间缩短D120see，仍可得到特异的产物，但每次循环时间可节约 25分钟。lD 利用新建的方法从脐血，正常婴儿及成人外周血中分离网织红细胞，Dl 提＆ RNA后，进行 RT－PCR 显示随着年龄的增长，胚胎型珠蛋白基因 lIy，。的相对量呈下降趋势，表现为。Iy．mopA从脐血的 0．54，到 61l 月时的 0．87，成人的 1刀5。a／。－mRNA自 1．42，1．76，到 2．36，符合已 lD 知基因表达切换规律，即在个体发牛发育过租中．琳胳型珠蛋R某田优Dl 无农这，随二渐被具他成人型基囚代督。且叶Y－mRNA的变化与HbFl 阴要化一欺。验证了本方法的可信性。进一步又对7例地中海盆血患者llgn＃ffi臼 iRNA作出相对定量，在两例携带 Q．地贫 l＄因的患者中，lD 检测到 g－mRNA RT－PCR产物，同时 a．mANA的 RT－pCR产物量明显下 DD 降，符合缺失型突变的预期的致病机理。旷纯合子较p’双重杂合子的DDa川－mRNA低，而旷杂合子则比其纯合子低．与预湖结讼一＠。以佑DD 外培养的淋巴细胞提取的RNA作空白对照，用RTPCR检测珠番白某田DD 转求水干，5份标本结果全阴，初步显示此方法假阳性率低。Dl 此足重万法侧步叹用显不，结果可靠，省时（较以前方法至少节约ll 三分之二时间），假阳性率低。l1．4．lI 此定量方法除可在各种地中海贫血突变基因的致病机理及人类珠蛋D 白基因表达切换规律的分析中应用外，尚可用于药物调控珠蛋白基因表D 达机理及珠蛋白基因表达调控机制等的实验研究中。由于