臭椿粗提物对水稻条纹病毒在水稻悬浮细胞中的作用机制

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近年来,水稻条纹叶枯病在各地爆发流行,给农业生产造成了严重的危害,在农业生产中还缺乏有效的防治药剂,因此筛选有效的病毒抑制剂并探索其作用机制,在研发水稻条纹病毒抑制剂过程中占有非常重要的位置。本研究以对水稻条纹病毒(RSV)感病的品种(武育粳3号)为材料建立水稻悬浮细胞体系,应用PEG介导与漩涡振荡相结合,将RSV接种到水稻悬浮细胞,用间接荧光抗体检测,在荧光倒置显微镜下观察RSV侵染水稻悬浮细胞的侵染率为30%-35%,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测病毒在悬浮细胞内的增殖周期,接种12h后外壳蛋白(CP)含量在细胞体内迅速增长,30h左右在细胞内的含量达到最大值,随后逐渐下降。利用悬浮细胞体系,建立病毒-细胞-药剂筛选体系,对已知的几种抗病毒药物进行筛选试验,采用酶联免疫吸附法(ELISA)和蛋白免疫杂交法(western-blot)对其抑制效果进行检测,发现臭椿粗提物对RSV有一定的抑制作用,抑制率为80%-90%;直接把病毒和臭椿粗提物混合,不同时间取样,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法检测了臭椿粗提物对CP的抑制效果,发现臭椿粗提物并不是直接对该病毒蛋白起降解作用;利用地高辛(DIG)标记,制备CP、SP基因的核酸探针,分别进行Northern-blot点杂交分析,发现臭椿粗提物对病毒mRNA在细胞体内的转录影响不大;但同时利用Real-Time PCR分析,发现臭椿粗提物能显著降低SP基因在细胞体内的转录,还能微量减少CP基因在细胞体内的转录。通过对病毒-寄主互作中有关主要防御酶(过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL))的酶活性测定,发现臭椿粗提物能使POD、PPO、PAL三种主要防御酶的酶活性增强,这表明臭椿提取物可能使寄主产生诱导抗性,能激发寄主产生与抗病有关的防卫反应。臭椿粗提物对RSV的作用机制可能表现在:臭椿粗提物不是对细胞内的CP直接起降解作用,细胞体内病毒蛋白含量的减少,可能是臭椿粗提物使寄主一些主要防御酶的酶活性增强,阻断了病毒mRNA表达的过程。
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