论文部分内容阅读
H5N1高致病性禽流感病毒(HPAIV)危害严重,不仅能引起家禽的大量死亡,造成巨大经济损失,而且还常常引起人发病,严重者可至人死亡。研究流感病毒与宿主相互作用关系,对于阐释流感病毒的致病机理至关重要。前期以实验室分离到的一株H5N1高致病性禽流感病毒感染A549细胞,利用蛋白质组学的方法,鉴定了一些差异表达的宿主蛋白,其中PHB蛋白表达水平在病毒感染宿主细胞后明显上调。因此,本研究进一步对其功能进行研究。主要研究成果如下:1.利用Real-time RT-PCR和western blot的方法检测A549细胞感染HPAIV后,PHB在不同时间点mRNA和蛋白水平的上调表达。2.构建了 PHB的真核表达质粒,通过Real-time RT-PCR和western blot验证其表达效果良好。在转染A549细胞后,用H5N1禽流感病毒感染细胞,利用Real-time RT-PCR、western blot、间接免疫荧光的方法证明在H5N1禽流感病毒感染A549细胞后,PHB促进病毒蛋白NP的合成。通过病毒蚀斑实验证明在H5N1禽流感病毒感染A549细胞后,PHB增加上清中的病毒滴度。均证明PHB促进H5N1禽流感病毒的增殖。3.PHB定位于A549细胞的细胞浆及细胞膜上,细胞核中极少量分布,主要定位于线粒体上。当病毒感染细胞时,PHB未发生位置改变,未出现入核现象。4.在未受到病毒感染和病毒感染的A549细胞中,PHB均能促进caspase-3蛋白酶的活化和底物PARP的切割,促进A549细胞凋亡的发生。5.通过双荧光素酶报告系统证明PHB抑制ISRE启动子的活性,进一步利用Real-time RT-PCR的方法证明PHB对I型IFN应答通路ISGs的抑制作用,western blot证明PHB抑制STAT1和STAT2的表达,均证明PHB可以拮抗I型IFN应答通路。