杂色鲍内脏褐藻酸酶的分离纯化和性质研究

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杂色鲍是我国海水养殖业的重要品种,为世界性养殖贝类之一。我国是杂色鲍产量和出口最多的国家。杂色鲍加工后产生大量下脚料,大多被随意丢弃。下脚料中的内脏可用于生产褐藻酸酶。褐藻酸酶作为杂色鲍的一种重要消化酶,在内脏中具有较高的表达量。褐藻酸酶根据降解褐藻酸上M段和G段的不同可分为甘露糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.3)和古罗糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.11)。本课题以杂色鲍为研究对象,对其内脏中的褐藻酸酶进行分离纯化,并研究其性质,为杂色鲍加工后下脚料的再利用提供理论基础。  从厦门市场购买来的杂色鲍为材料,通过匀浆抽提,硫酸铵分级分离,Sephacryl-200分子筛柱层析和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析,分离纯化了褐藻酸酶。SDS-PAGE结果显示为电泳单一纯,纯化倍数为31.6,得率为37.3%,分子量为35.5 kDa。杂色鲍褐藻酸酶的最适pH为5.5,最适温度为45℃。褐藻酸酶在pH4.0-8.0,温度小于50℃环境下活性较稳定。褐藻酸酶水解对硝基苯基-alpha-D-甘露糖苷的Km和Vm分别为0.89 mmol/L和0.78mmol/(L·min)。该酶属于甘露糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.3)  化学修饰研究结果表明:组氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基和羧基是褐藻酸酶的活性功能基团,而丝氨酸残基,精氨酸残基和氨基不是该酶活性中心必需的.  研究金属离子对褐藻酸酶活力的影响表明:Li+、Na+、K+和Mg2+对褐藻酸酶活力几乎没有影响,Ca2+有轻微激活作用,而Co2+、Mn2+、Zn2+、Al3+、Fe3+、Cu2+和Hg2+有不同程度的抑制作用,Cu2+和Hg2+具有抑制作用,抑制类型表现为不可逆抑制。  研究有机溶剂对褐藻酸酶活力的影响表明:醇类中的甲醇,乙醇,丙醇,乙二醇,丙二醇和丙三醇对褐藻酸酶活力均有不同程度的抑制,乙二醇的抑制效果最明显,表现为非竞争型抑制,抑制常数为1.48 mol/L;丙酮、二氧六环和酰胺类物质对褐藻酸酶活力也有不同程度的抑制,丙酮和二氧六环均表现为竞争型抑制,抑制常数KI分别为0.36 mol/L和1.26 mol/L,甲酰胺表现为混合型抑制,抑制常数KI为0.23 mol/L,KIS为0.48 mol/L。
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