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背景:多发性骨髓瘤(Multiple myeloma MM)是以克隆性浆细胞恶性增殖为特征的血液系统肿瘤,目前年发病率为4-6/100000,是发病率排第二位的血液系统恶性肿瘤[1-5]。其临床表现为贫血,肾功能损害,高钙血症、骨质破坏等,随着自体造血干细胞移植的广泛开展和蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂以及靶向药物等新药的不断出现,多发性骨髓瘤的完全缓解率和长期生存率[6-7]已经得到明显改善。但是,大约超过半数的多发性骨髓瘤患者容易发生溶骨性破坏也称之为骨髓瘤骨病(Myeloma bone disease,MBD),其特征是严重的骨痛,骨折,骨质疏松症和高钙血症[8-9]。骨髓瘤骨病中的骨破坏通常归因于破骨细胞活性的增强和成骨细胞功能的减弱之间的不平衡所致。成骨作用是通过骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)的分化介导而成的,骨髓间充质干细胞具有成骨分化的潜力[10]。既往的研究表明多发性骨髓瘤患者间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)BMMSCs的成骨分化受损[11]。因此,改善MM-MSC的成骨分化能力是可促进骨再生和修复的关键问题。Micro RNAs(miRNAs或miRs)是高度保守的短的非编码RNA分子,既往研究认为其参与炎症、胚胎发育,造血、免疫等诸多生物过程,是细胞增殖,分化,器官发育和代谢的调节因子[12]。许多研究表明,miRNA表达的失调是多发性骨髓瘤可能的发病机制[13],此外,miRNA在MSC的自我更新和分化[14-15]中发挥关键作用。而在成骨分化过程中,既往许多研究报道,miRNA包括miR-133[16],miR-141[17]和miR-34a[18]等均参与了成骨分化过程,通过调节关键转录因子促进或抑制间充质干细胞和成骨细胞的分化。虽然既往已经有不同的microRNA、LncRNA针对于MSC成骨分化的作用研究,但是既往的研究仅限于单类型或者单个RNA,或单类型多个RNA对基因作用的方式研究,未能系统全面的了解和诠释MSC发育相关的基因调控。因此,本研究旨在通过二代测序技术,筛选出骨髓瘤骨病患者间充质干细胞与正常对照组间充质干细胞成骨分化间circRNA、LncRNA、mRNA、microRNA表达差异,并绘制网络图,挑选其中差异表达的RNA进行初步验证,明确其调控成骨分化的机制和通路,为全面研究RNA调控间充质干细胞成骨分化的作用机制打下基础,为治疗多发性骨髓瘤提供新的干预靶点。目的:通过分析骨髓瘤骨病患者和正常对照组MSC在成骨分化中的circRNA、LncRNA、mRNA、microRNA差异性表达,并通差异性表达的microRNA进行生物信息学分析,寻找最可能的miRNA及其靶基因,并进行相关的验证,从而明确microRNA在骨髓瘤骨病MSC成骨分化中的作用。方法:本研究分三部分内容第一部分:MBD患者不同病情严重程度的MSC和骨髓瘤细胞含量和抗原表达差异(1)MBD病情确认:确认多发性骨髓瘤患者合并骨髓瘤骨病病例,排除其他基础代谢疾病,排除传染性疾病感染,排除其他疾病所导致的骨质破坏。(2)标本收集:选择多发性骨髓瘤合并骨髓瘤骨病患者骨髓和外周血标本作为实验组,选择正常人骨髓和外周血标本作为对照组,实验组和对照组骨髓标本经流式细胞检测和鉴定骨髓瘤细胞和间充质干细胞,并对骨髓瘤细胞和间充质干细胞进行免疫表型鉴定和分离,并对间充质干细胞进行富集和纯化。第二部分:差异性circRNA、LncRNA、mRNA、microRNA筛选:(1)分别提取实验组和对照组的RNA,进行RNA样品预处理后,进行RNA全转录本二代测序。(2)根据二代测序结果,分析差异性表达的circRNA、LncRNA、mRNA、microRNA,根据生物信息学分析,将它们分别与靶基因构建了调节网络图;然后,挑选部分差异表达的RNA进行成骨分化的验证试验。第三部分:验证实验(以第二部分筛选的数据结果为依据)(1)茜素红染色及RT-q PCR证实MM-MSC与N-MSC成骨细胞分化的差异。(2)确定筛选出的microRNA,RT-q PCR分析来自MM-MSC与N-MSC中microRNA的表达水平。(3)通过网络数据库,预测筛选出的microRNA可能结合的靶基因。(4)荧光素酶试验确定筛选出的靶基因参与成骨分化。(5)通过慢病毒载体过表达筛选出的靶基因,通过Western blot分析其蛋白表达水平。(6)通过Western blot分析成骨分化相关通路的蛋白表达水平。结果:1.MM-MSC与N-MSC存在差异性表达的circRNA、LncRNA、mRNA、microRNA,经过生物信息学分析,选择miR-203a-3p.1、miR-221-5p进行成骨分化验证实验。2.miR-221-5p在MBD-MSC中以低水平表达,并且是参与成骨分化的负调节物。miR-221-5p通过上调smad3来调节成骨分化,作用机制可能涉及通过抑制miR-221-5p的活性增加PI3K/AKT/m TOR的磷酸化。3.miR-203a-3p.1在MM-MSCs中下调,并参与成骨分化,miR-203a-3p.1通过直接靶向Smad9作为成骨细胞分化的负调节剂,作用机制可能与Wnt3a/β-catenin蛋白信号传导途径的激活有关。结论:1.MM-MSC与N-MSC存在差异性表达的circRNA、LncRNA、mRNA、microRNA;2.miR-221-5p在MBD-MSC中以低表达,通过上调smad3增加PI3K/AKT/m TOR的磷酸化来调节成骨分化;3.miR-203a-3p.1在MM-MSCs中下调,通过直接靶向Smad9作为成骨细胞分化的负调节剂,作用机制可能与Wnt3a/β-catenin蛋白信号传导途径的激活有关;4.miR-221-5p和miR-203a-3p.1有望成为骨髓瘤骨病的治疗方法。