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一、研究背景和目的间变性大细胞淋巴瘤(Anaplastic large cell lymphoma,ALCL)是非霍奇金淋巴瘤中的一个特殊类型,是由一组形态、表型、细胞遗传学和临床病程各异的疾病组成,其细胞形态变化多样,特征为淋巴结副皮质区和窦状隙内有表达CD30的间变性大淋巴细胞浸润。但由于该标志特异性不强,以往有许多病例被误诊为恶性组织细胞增生症、窦状隙大细胞淋巴瘤、退行性非典型组织细胞增生、转移癌、黑色素瘤或淋巴细胞消减型霍奇金病等,因此病理亟待寻找更特异的诊断标记物。间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)是ALCL病例中比较特异的标志。遗传学研究发现约60%-85%ALCL患者存在ALK融合蛋白,这是由于2号染色体的ALK基因与5号染色体的核磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM)基因融合导致。值得注意的是,ALK基因在绝大多数非造血系统肿瘤和正常组织中缺乏表达,且有ALK融合基因的ALCL病例预后要明显好于阴性病例,二者的临床特征有很大差异,可将ALCL分为ALK阳性ALCL及ALK阴性的ALCL,由此可见检测ALK对于病理诊断意义重大。组织微阵列(tissue microassays)是由大量组织标本高密度排列而成的,具有高信息量,实验误差小,标本利用率高和成本低等优点;如同普通组织切片一样可以做苏木素和伊红(hematoxylin and eosin,HE)、特殊组织化学、免疫组化染色和原位杂交,应用于寻找肿瘤基因、检测生物试剂等方面。染色体荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)技术近年己广泛应用于医学生物领域,但在国内病理诊断中的应用非常少见,除了商品化探针价格昂贵、实验结果观察需要特殊设备外,对材料的要求比较高也是一个重要因素。日常病理工作中的材料多为福尔马林固定石蜡包埋组织,而国内目前成功地对福尔马林固定石蜡包埋组织微阵列(tissue microarray,TMA)进行FISH实验研究报道极少。本实验运用组织芯片技术和核芯片技术,观测30例ALCL病理学特征、免疫表型特征、T细胞β、γ受体基因重排情况;同时运用FISH及免疫组化方法对福尔马林固定石蜡包埋ALCL的组织芯片中ALK融合基因其产物进行对比检测,比较它们在临床诊断中的作用,并探讨ALK融合基因其产物与患者预后的关系。二、方法收集1997-2005年间30例ALCL的临床资料较齐全病例并进行随访。采用2001年WHO关于淋巴造血组织肿瘤分类进行组织学分型。使用组织微阵列技术,构建了包含30例ALCL及2例对照组织(每例3个点)共96点阵的石蜡组织芯片。免疫组化染色采用链霉素抗生素蛋白——过氧化物酶(SP)法,分别对室温保存的组织芯片做CD3、CD20、CD45RO、CD79a、CD30和ALK标记,以进一步明确免疫表型和ALK的表达等。应用PCR检测TCR-β、TCR-γ受体基因重排。采用双色FISH检测ALCL病例中的ALK融合基因。统计学方法上,使用SPSS软件(SPSS13.0 for Windows)进行One-wayANOVA检验,以P＜0.05作为差异显著性标准来检验之间的差异性。三、结果1、组织学:原发皮肤型ALCL2例,系统性ALCL28例。系统性ALCL分为普通型22例(22/28,78.6%),淋巴组织细胞型4例(4/28,14.3%),小细胞型2例(2/28,7.1%)。2、免疫组织化学:30例ALCL中,29例CD30阳性(29/30,96.7%),23例T细胞标记阳性(CD3和/或CD45R0阳性),另7例无T细胞标记为阴性(CD3和CD45R0均阴性)。2例原发皮肤型ALK表达为阴性;28例系统性ALCL中有20例(71.4%,20/28)ALK阳性,其中普通型16例(72.7%,16/22),淋巴组织细胞型3例(75%,3/4),小细胞型1例(50%,1/2);经统计学分析,ALK表达在各组织学亚型中无显著性差异(P＞0.05)。20例ALK阳性的病例中17例为T细胞标记阳性,余3例为T、B细胞标记均阴性。ALK表达定位在细胞浆与细胞核。3、基因重排检测:2例原发皮肤型ALCL中1例(1/2,50%)同时检测到T细胞β和γ受体基因重排;28例系统性ALCL中20例(20/28,71.4%)检测到T细胞γ受体基因重排,13例(13/28,46.4%)检测到T细胞β受体基因重排,11例(11/28,39.3%)同时检测到T细胞β和γ受体基因重排。4、FISH检测:在17例(17/28,60.7%)系统性ALCL中检测到ALK融合基因,而2例原发皮肤型ALCL中FISH阴性。5、在30例ALCL中,ALK蛋白阳性组的年龄低于ALK蛋白阴性组的年龄,两者差异具有显著性(P=0.003)。ALK蛋白阳性组的预后好于ALK蛋白阴性组的预后,两者差异具有显著性(P=0.0018)。四、结论本研究通过对30例ALCL病例的组织病理学、免疫表型以及TCR基因重排的研究分析及同时运用FISH及免疫组化方法检测了福尔马林固定石蜡包埋ALCL的组织芯片中ALK融合基因其产物。实验结果经过统计学分析后得出以下结论:1.由于检测到ALK融合基因的ALCL病例与未检测到ALK融合基因的ALCL在临床珍断和预后上有着显著的差异性,因此区分两者很有意义。2.ALK免疫组化染色在检测ALK融合蛋白时具有较高的敏感性,FISH在检测ALK基因转位时具有较高的特异性,而ALK融合蛋白免疫组化染色由于其简单、快捷、价廉成为常规病理外检中的首选方法,在具备FISH条件时,由于其准确性也可以将检测ALK基因转位作为首选。3.首次联合运用组织芯片技术,免疫组化和荧光原位杂交检测石蜡包埋间变性大细胞淋巴瘤ALK融合基因及其产物,效果良好,在临床病理诊断中有着良好的应用前景。4、ALK融合基因及其产物在ALCL病例中有很高的检出率,尤其是低年龄组的患者,它可以成为ALCL的诊断、鉴别诊断和判断预后的一个独立重要指标。