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1研究背景随着社会的发展，创伤日益增多，被称为“发达社会疾病”，呈现出发病年轻化、伤势复杂化、高度致残化的特点，而其中骨折最常见。骨折的发生率迅猛增加，骨折严重程度、并发症也显著增加，严重地威胁着人类的健康。如何促进骨折的修复、加速骨折愈合一直为骨科领域研究的重要课题。中医药治疗骨折历史悠久，有着丰富的经验和深厚的理论，其中骨折三期治则是中医骨折内治法的指导原则。它的提出对统一骨伤界对骨折治疗的认识、规范骨折临床治疗方案、推动中医骨伤科学的发展起到了积极作用。目前对于中药促进骨折愈合的研究多集中在单一方剂、单味中药，或强调中药有效成分的应用等。多是从中药对骨折愈合全过程或对某一类细胞的影响等方面进行研究。而对于分阶段用药治疗骨折的研究鲜见报道，系统的骨折三期治疗研究则更少。为了研究骨折三期治疗对骨折愈合的作用和机制，我们前期进行了这方面探索性的研究工作，发现各中药治疗组对FGF-2表达高峰出现较提前，高峰持续时间增加，三期治疗组有高于一期治疗组的趋势。因此对骨折进行分期辨证治疗是非常必要的，其作用机制与促进骨折局部FGF-2表达有关。为进一步深入研究骨折三期治则的作用机理，我们设计了本次实验。采用家兔桡骨中下1／3处3mm骨质缺损的动物模型，应用组织学、原位杂交和免疫组化方法对骨折三期治则对骨折愈合的作用和骨折愈合过程中骨痂各种组织VEGF及其mRNA表达的影响做初步探讨。2材料与方法研究设计类型：采用双因素一元析因设计方案。2．1实验动物及建立骨折模型新西兰家兔140只，于双侧桡骨中下1／3用特制骨锯造成3mm完全骨质缺损的动物模型，不作任何固定。术后用SPSS软件产生随机数字的方法将140只家兔随机分为四个实验组，每组35只。分别为中药三期治疗组(简称三期组)、中药一期治疗组(简称一期组)、模型对照组(简称模型组)和阳性药物组(简称阳性药组)，每个实验组再随机分为7个小组，每小组5只家兔。2．2干预方法2．2．1给药方法本实验所用的基本方剂是采用高等中医药院校统编教材《中医正骨学》和《骨伤科学》中的肢伤一方、二方及三方。三期组按照中医骨折三期治疗原则及家兔桡骨中下段骨折愈合的组织学变化将骨折愈合过程分为三期，早期为术后1～7天，相当于血肿机化演进期，给予肢伤一方；中期为术后8～28天，相当于原始骨痂形成期，给予肢伤二方；后期为术后29天以后，相当于改造塑型期，给予肢伤三方。一期组将骨折愈合过程不分期，给予肢伤一方、二方与三方的综合加减方(一期方)。阳性药组将骨折愈合过程不分期，给予骨折挫伤胶囊水溶液。给药剂量为家兔对人等效剂量的两倍，每日分两次灌胃。模型组给予等量蒸馏水灌胃。2．3标本处理术后第3、6、9、14、28、42、56天每个实验组随机抽取一小组家兔用空气栓塞法处死。取左侧桡骨标本为研究对象，经固定、脱钙、包埋等程序后行HE染色，并采用免疫组化和原位杂交方法观察骨折愈合不同时间点骨痂VEGF因子及其mRNA表达情况。采用显微图像采集系统对免疫组化及原位杂交切片骨折断端附近的骨干细胞、骨外膜、骨内膜、血肿、纤维骨痂、软骨骨痂、骨小梁、小梁间组织及骨髓组织各取两个高倍镜视野，并用ImagePro plus 5.0图像分析软件对这些组织中的阳性表达细胞的平均光密度值(MOD)进行测定。2．4统计分析应用SAS统计软件对实验数据进行统计分析。对骨折愈合过程中每种组织阳性表达细胞MOD值的组间差异进行统计分析，并对每个时间点数据进行组间两两比较。结果采用均数±标准差((?)±s)表示。检验水准：α=0.053结果3．1中药对骨折愈合作用的组织学研究4从骨折愈合的组织学评分结果来看，三个中药治疗组在术后大部分时间点组织学评分均有高于模型组的趋势，骨折愈合过程中平均得分模型组最低。三期组平均得分最高，与其它三组相比差异非常显著，p<0.01。同时一期组和对照平均得分也有高于模型组的趋势，p=0.079和0.059，接近显著性差异界限，增大样本量后差异会更加显著。在骨折愈合的时间上，各中药治疗组未见明显提前，但从肉眼观察结果来看，各中药治疗组骨折愈合后期骨痂质量及成熟程度较模型组好，倘若增加观测时间点及提高样本量，各中药治疗组和模型组在愈合时间上的差异可能会出现。三期组在术后9天～42天大部分时间点得分均最高。说明三期治疗能够显著提高骨折中后期骨痂得分，促进骨折愈合。因此，中药对骨折愈合具有一定的促进作用，三期治疗对于骨折愈合的促进作用更强。3．2中药对骨折愈合过程中骨干细胞VEGF表达的影响皮质骨在骨折后，从初级到次级哈氏系统，从哈佛氏管到板层骨，以致于哈佛氏系统和板层骨中的骨细胞、成骨细胞，均处于非常活跃的状态。骨折后4天，近骨折端骨皮质表面外环板及哈佛氏系统的骨细胞变形增大，颜色加深，排列紊乱。哈佛氏管逐渐增粗变形，至骨折第14天时哈佛氏管已明显扩大，并分别穿过内外环板进入髓腔及到皮质外。骨折4周前后，主要表现为皮质骨中的管道增生。约在骨折5、6周，皮质外及断端间血管管道周围开始形成骨细胞。有些细胞又各自形成不典型的新哈氏系统及骨小梁。从免疫组化和原位杂交结果来看，各中药治疗组对整个骨折愈合过程中骨干细胞VEGF及mRNA的表达均有促进作用，可以促进骨干中的血管再生，促进哈氏管塑型改建。三期组在促进骨折早期和后期VEGF及其mRNA的表达上更佳。3．3中药对骨折愈合过程中骨外膜VEGF表达的影响从骨折后6天开始，骨外膜开始增厚，骨外膜内层的骨原细胞增生肥厚，逐渐形成骨样组织和软骨。骨外膜VEGF表达区域主要集中在骨膜间充质细胞、血管内皮细胞和骨皮质表面的破骨细胞上。从免疫组化和原位杂交结果来看，各中药治疗组对整个骨折愈合过程中骨外膜VEGF及mRNA的表达均有促进作用，尤其是骨折愈合的中后期，三个中药治疗组VEGF及mRNA的表达均高于模型组。三期组在术后6～56天大部分时间点VEGF表达均最强。3．4中药对骨折愈合过程中骨内膜VEGF表达的影响术后3天即可见到骨内膜增厚，最早在术后6天，骨内膜已有少量类骨组织形成，并且迅速增长，在术后9天已有部分标本骨髓腔内充满新生骨小梁，说明骨内膜在骨折愈合中具有显著的作用。在骨内膜的成纤维细胞、间充质细胞、成骨细胞、破骨细胞以及炎细胞中均可见到VEGF阳性表达。从免疫组化和原位杂交结果来看，各中药治疗组对整个骨折愈合过程中骨内膜VEGF及mRNA的表达均有促进作用，三期组在骨折愈合的3～14天VEGF及mRNA的表达强度均高于其它三组，三期组对骨折愈合早中期骨内膜VEGF表达有明显促进作用，促进内骨痂形成。3．5中药对骨折愈合过程中血肿VEGF表达的影响骨折后的血肿中均可见明显的VEGF表达，主要集中在血肿机化后的网状纤维组织和血肿中的炎细胞中。术后六天开始血肿中的表达VEGF的网状纤维组织中开始出现钙质沉积。从免疫组化和原位杂交结果来看，各中药治疗组对骨折后6～14天血肿中VEGF及mRNA的表达均有明显的促进作用，三期组VEGF及mRNA的表达最高。3．6中药对骨折愈合过程中纤维骨痂VEGF表达的影响术后3天即可见到个别标本骨折端有成纤维细胞的聚集，术后9天绝大部分标本骨折端均有成纤维细胞的聚集，大量成纤维细胞和新生毛细血管侵入血肿增加，逐渐形成连接两骨折端的纤维骨痂，纤维骨痂中某些纤维细胞增粗，核仁变大，并逐渐钙化，逐步形成类骨组织。在纤维骨痂的血管内皮细胞、炎细胞以及纤维结缔组织中有VEGF表达。从免疫组化和原位杂交结果来看，各中药治疗组对骨折后14～28天纤维骨痂中VEGF及mRNA的表达有明显的促进作用，三期组对于对于VEGF mRNA的促进作用更明显。3．7中药对骨折愈合过程中软骨骨痂VEGF表达的影响术后9～42天，在骨外膜区可见大片由透明软骨区域，有大量透明软骨胞浆或基质中可见VEGF阳性表达。从免疫组化和原位杂交结果来看，各中药治疗组对骨折后软骨骨痂中VEGF及mRNA的表达促进作用，三个中药治疗组对于软骨骨痂VEGF表达的促进作用相差不多，但在术后28～42天一期组VEGF及mRNA表达较低。3．8中药对骨折愈合过程中骨小梁VEGF表达的影响从术后6天开始，内骨外膜中的纤维母细胞开始显著增粗，分化成骨母细胞和软骨母细胞，进一步分化成类骨组织和软骨骨痂，类骨组织在进一步形成编织骨，形成骨小梁。软骨骨痂发生毛细血管的侵入和钙盐沉积，逐渐形成骨小梁。部分骨小梁的骨细胞胞浆里可以观察到VEGF阳性表达。从免疫组化和原位杂交结果来看，各中药治疗组对术后大部分时间点骨小梁中VEGF及mRNA的表达有促进作用，主要表现在术后14～42天，三期组则对术后各个时间点骨小梁VEGF表达均有促进作用。3．9中药对骨折愈合过程中小梁间组织VEGF表达的影响以膜内成骨和软骨内成骨形成的骨痂非常脆弱，需要经过骨改建才能使之恢复成熟骨的形态，并适应新的功能需要。骨改建是一个相当长过程，是一个骨吸收——沉淀的过程，主要由破骨细胞和成骨细胞参与，单核细胞、骨细胞和衬细胞也参加和调节骨改建过程。术后14到56天，在骨小梁间的血管内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞、髓样组织中均有VEGF阳性表达。从免疫组化和原位杂交结果来看，各中药治疗组对术后14～56天各个时间点小梁间组织中VEGF及mRNA的表达有促进作用，而三期组在术后42～56天对小梁间VEGF表达促进作用非常明显。3．10中药对骨折愈合过程中骨髓组织VEGF表达的影响骨髓具有诱导成骨的能力，在术后个时间点均可见到骨髓组织中VEGF阳性表达，主要在骨髓血管内皮、间充质细胞、网状纤维以及炎细胞等组织。VEGF表达在术后两周内表达较高，两周后VEGF表达开始逐渐下降。各中药治疗组在骨折后大部分时间点VEGF表达均高于模型组，三期组对骨折愈合早期和后期骨髓VEGF表达促进作用较明显。4结论1)中药可以促进骨折愈合过程中VEGF的表达，这可能是中药促进骨折愈合的机制之一。2)中药对骨折愈合不同阶段各种组织的VEGF表达有不同的作用，根据骨折愈合不同阶段施以相应治则的分期治疗较不分期治疗对于VEGF表达的促进作用更明显，显示中医骨折分期治疗是必要的。3)中医骨折三期治则分别针对骨折愈合不同时期的病理变化，促进相应部位的VEGF表达，三期治则是较好的骨折分期治疗方法。5创新点1)研究了骨折愈合过程中不同组织VEGF表达量的变化特征。目前对于骨折愈合过程中VEGF表达的研究多为骨痂组织VEGF表达的定量，对各种不同组织中VEGF表达分别进行定量研究未见报道。2)采用免疫组化和原位杂交方法研究了骨折三期治疗对家兔骨折愈合过程中VEGF表达的影响，探讨了骨折三期治疗对骨折愈合促进作用的机制。目前对中药促进骨折愈合的研究主要集中在单味药和单一方剂，对于骨折三期治则的研究较少。通过观察骨折愈合过程中VEGF表达来研究骨折三期治则对骨折愈合作用未见报道。