论文部分内容阅读
背景:临床上,由于各种急慢性致伤因素,如烧伤、机械暴力、外科手术、慢性溃疡等所导致的皮肤损伤十分常见,给患者家庭及社会经济发展带来沉重负担。皮肤创面修复是角质形成细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、炎性细胞、细胞外基质、细胞因子及生长因子等多因素共同参与、高度协调、相互调控的复杂过程。真皮成纤维细胞被皮肤损伤激活,随后发生的增殖、迁移、分化、合成包括胶原在内的细胞外基质及分泌多种细胞因子等生物学行为是创面修复的基础。因此,任何改变真皮成纤维细胞生物学性状及功能的内源性或外源性因素均可能影响创面修复进程。研究证实,真皮成纤维细胞是一个异质性细胞群体,皮肤中至少存在两群具有独特表型和功能的成纤维细胞,CD26不仅可以作为区分不同成纤维细胞亚群的新型标志物,而且可能在调控真皮成纤维细胞生物学行为进而影响皮肤创面修复的过程中发挥重要作用。目的:阐明CD26对真皮成纤维细胞生物学行为的影响及其发挥作用的具体分子机制,进一步明确CD26在皮肤创面修复及真皮再生中的作用。为完善创面修复的分子机制提供新线索,为寻找促进创面修复的药物靶点乃至探索加速创面修复的新策略提供理论依据。方法:首先分离及原代培养人真皮成纤维细胞,利用重组腺病毒介导的基因干扰及过表达技术,分别构建低表达CD26基因及过表达CD26基因的人真皮成纤维细胞模型。通过qRT-PCR、Western blot等方法检测腺病毒感染效率;通过细胞功能学实验及流式细胞术检测CD26基因干扰和过表达后对成纤维细胞增殖及克隆形成能力、迁移能力、黏附能力、合成及分泌胞外基质能力、凋亡、细胞周期分布的影响;通过Agilent表达谱基因芯片对CD26低表达的成纤维细胞进行差异基因筛选、GO分析、Pathway分析、聚类分析,预测及验证CD26在真皮成纤维细胞中发挥调控作用的关键信号分子及相应的信号通路。体内实验部分,将健康、雄性、4-5周龄、SPF级BALB/C裸鼠,随机分为实验组和对照组,于裸鼠背部正中构建抗收缩全层皮肤缺损模型,取50μl滴度为1010PFU/ml的重组腺病毒溶液,与150μl无菌生理盐水溶液混匀后,分8个点于裸鼠皮肤创缘皮内均匀注射,每点注射约20μl,其余40μl喷洒于皮肤创面。术后第0、3、7、11、15d,对创面进行大体观察并拍照记录,每组各取2只动物处死,切取背部整个创面及邻近正常皮肤,行组织病理、免疫组化、免疫荧光及分子生物学检测,评估创面修复及真皮再生情况。结果:1.利用重组腺病毒介导的基因干扰及过表达技术,成功构建低表达CD26基因和过表达CD26基因的人真皮成纤维细胞模型。2.低表达CD26的成纤维细胞增殖及克隆形成、迁移、黏附、合成及分泌胞外基质能力减弱;CD26过表达后成纤维细胞上述能力增强。3.低表达CD26可诱导成纤维细胞发生凋亡;过表达CD26可抑制成纤维细胞发生凋亡,尤其是早期凋亡。4.低表达CD26可诱导成纤维细胞发生G0/G1期阻滞;CD26过表达的成纤维细胞G0/G1比例下降,S+G2/M期比例升高,进入DNA复制及有丝分裂的细胞比例增加。5.CD26通过PI3K/AKT介导的p21/p27/CyclinD1信号转导途径参与调控成纤维细胞的周期分布及增殖能力;通过PI3K/AKT介导的mTOR/p70S6K/4EBP1/MMP-9信号转导途径参与调控成纤维细胞的迁移能力;通过PI3K/AKT介导的Bad/Bcl-2/Caspase-3/PARP信号转导途径参与调控成纤维细胞的凋亡。6.创缘皮内注射的腺病毒可高效感染裸鼠创面组织与细胞,并显著干扰或过表达创面周边组织中CD26的表达量。7.裸鼠皮肤创面愈合时间、上皮化进程、创面组织中包括新生胶原在内的细胞外基质沉积均随着CD26表达水平的增高而明显加快。结论:1.CD26可以通过调节真皮成纤维细胞的生物学行为及功能,进而影响皮肤创面修复进程及结局。2.PI3K/AKT介导的下游信号转导途径可能是CD26发挥作用的潜在机制:通过p21/p27/CyclinD1信号转导调控成纤维细胞的周期分布及增殖能力;通过mTOR/p70S6K/4EBP1/MMP-9信号转导调控成纤维细胞的迁移能力;通过Bad/Bcl-2/Caspase-3/PARP信号转导调控成纤维细胞的凋亡。